[發(fā)明專利]一種基于NGS平臺(tái)的微生物定量方法及試劑盒

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210609186.5
• 申請(qǐng)日: 2022-05-31
• 公開（公告）號(hào): CN114891868A
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳丹;李秋芳;朱鵬遠(yuǎn);吳春求;余成鵬;吳靜;王楊;陳嘉昌;柳俊;胡朝暉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州市金圻睿生物科技有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869;C12Q1/689;C12N15/11;C12R1/445;C12R1/22;C12R1/385;C12R1/32;C12R1/01
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 王艷齋

1.一種基于NGS平臺(tái)的微生物定量方法，其特征在于，所述微生物定量方法包括：

將針對(duì)目標(biāo)微生物的基因組上目標(biāo)區(qū)域的引物和鏡像序列與待測(cè)樣本混合，進(jìn)行文庫(kù)制備及測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果計(jì)算目標(biāo)微生物含量；

所述鏡像序列包括引物結(jié)合區(qū)和非引物結(jié)合區(qū)，所述引物結(jié)合區(qū)的核酸序列與所述目標(biāo)微生物的基因組上目標(biāo)區(qū)域的引物結(jié)合區(qū)的核酸序列相同，所述非引物結(jié)合區(qū)與所述目標(biāo)微生物的基因組上目標(biāo)區(qū)域的非引物結(jié)合區(qū)互補(bǔ)或?yàn)槠浞聪蚝怂嵝蛄小?/p>

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于NGS平臺(tái)的微生物定量方法，其特征在于，所述計(jì)算的公式如式(1)所示；

Cp＝(Ci×Rp×Vi)/Ri 式(1)；

其中，Cp為目標(biāo)微生物的含量，Rp為目標(biāo)微生物擴(kuò)增到序列數(shù)，Ci為鏡像序列的投入濃度，Vi為投入鏡像序列后與投入鏡像序列前的體積比，Ri為鏡像序列擴(kuò)增到序列數(shù)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于NGS平臺(tái)的微生物定量方法，其特征在于，所述鏡像序列被插入到質(zhì)粒中。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的基于NGS平臺(tái)的微生物定量方法，其特征在于，所述方法還包括設(shè)計(jì)引物的步驟；

優(yōu)選地，所述設(shè)計(jì)引物包括：獲取目標(biāo)微生物基因組序列，篩選目標(biāo)區(qū)域，針對(duì)目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)引物。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的基于NGS平臺(tái)的微生物定量方法，其特征在于，所述文庫(kù)制備包括：對(duì)目標(biāo)微生物的基因組上目標(biāo)區(qū)域及其鏡像序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到文庫(kù)；

優(yōu)選地，所述PCR包括多重PCR。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的基于NGS平臺(tái)的微生物定量方法，其特征在于，所述測(cè)序包括靶向測(cè)序。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的基于NGS平臺(tái)的微生物定量方法，其特征在于，所述目標(biāo)微生物包括鮑曼不動(dòng)桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、卡他莫拉菌、銅綠假單胞菌或結(jié)核分枝桿菌中的任意一種或至少兩種的組合。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于NGS平臺(tái)微生物定量方法，其特征在于，所述鮑曼不動(dòng)桿菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列；

優(yōu)選地，所述鮑曼不動(dòng)桿菌的鏡像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列；

優(yōu)選地，所述金黃色葡萄球菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列；

優(yōu)選地，所述金黃色葡萄球菌的鏡像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列；

優(yōu)選地，所述肺炎克雷伯菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的序列；

優(yōu)選地，所述肺炎克雷伯菌的鏡像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.9所示的序列；

優(yōu)選地，所述卡他莫拉菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的序列；

優(yōu)選地，所述卡他莫拉菌的鏡像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.12所示的序列；

優(yōu)選地，所述銅綠假單胞菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的序列；

優(yōu)選地，所述銅綠假單胞菌的鏡像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.15所示的序列；

優(yōu)選地，所述結(jié)核分枝桿菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的序列；

優(yōu)選地，所述結(jié)核分枝桿菌的鏡像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.18所示的序列。