[發明專利]一種NMDAR的NR1亞基缺失突變體、突變體細胞及構建方法和應用

有效

• 申請號: 202210607252.5
• 申請日: 2022-05-31
• 公開（公告）號: CN114957444B
• 公開（公告）日: 2023-09-19
• 發明（設計）人: 李科;郝文斌;閆亞平;趙子越;程靜美;封雪
• 申請（專利權）人: 陜西脈元生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/705
• 分類號: C07K14/705;C12N15/12;C12N15/10;C12N5/10;G01N33/564
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 蘇士瑩

本發明提供了一種NMDAR的NR1亞基缺失突變體、突變體細胞及構建方法和應用，涉及自身抗體檢測技術領域。本發明對NR1亞基的特定位點進行缺失，并由缺失了NMDARNR1亞基部分氨基酸的突變體與NMDARNR2亞基共轉，從而建立了在不需要拮抗劑的情況下穩定表達NR1和NR2亞基的細胞檢測系統，以檢測待檢樣本中NMDAR自身抗體。本發明得到的所述突變體細胞可與抗NMDAR腦炎患者中的自身抗體結合，一方面建立了不需要添加拮抗劑、可穩定表達識別NMDAR自身抗體的檢測體系；另一方面得到了“球狀”背景低的識別NMDAR自身抗體的檢測體系。

技術領域

本發明屬于自身抗體檢測技術領域，具體涉及一種NMDAR的NR1亞基缺失突變體、突變體細胞及構建方法和應用。

背景技術

NMDAR是配體門控的陽離子通道，在突觸的傳遞和可塑性中起著至關重要的作用。NMDAR是由GluN1和GluN2(A-D)亞基組成的異構體，分別結合甘氨酸和谷氨酸。GluN1和其中一種GluN2結合形成具有不同藥理特性的受體。GluN1單亞基不能在中樞神經系統組織中形成功能受體，需要與其他亞基結合才能在神經元細胞表面表達。

2008年，Dalmau等人提出了抗NMDAR腦炎的概念，這是一種由?NMDAR自身抗體介導的嚴重的、潛在致命的自身免疫性疾病。由于副腫瘤性抗NMDAR腦炎在腫瘤切除和免疫治療后有更好的預后，因此有必要建立快速檢測系統，以檢測針對NMDAR抗原表位的自身抗體。一般認為，NMDA?受體是由兩個NR1亞單位和兩個NR2亞單位構成的異四聚體。因此，建立識別NMDAR自身抗體的檢測體系，就需要建立穩定表達每個NMDA受體亞基的細胞。然而，培養基中的谷氨酸和甘氨酸激活的NMDAR?Ca²⁺內流對非神經元是有毒的，當NMDAR的NR1和NR2亞基同時在非神經元細胞中過表達時，會產生細胞毒性，造成靶細胞死亡。已有學者探究出可同時過表達NMDARNR1和NR2亞基的方法，Tanaka等人通過在培養基中添加拮抗劑MK-801以保護過表達NR1和NR2亞基的HEK293細胞(Tanaka?K,?Kitagawa?Y,Hori?K,etal.Evaluation?of?the?concordance?between?GluN1-GluN2?heteromer?live-cell-based?assay?and?GluN1?monomer?biochip?kit?assay?on?anti-NMDAR?autoantibodydetection[J].Journal?of?Immunological?Methods,?2021,499:113150.)；Thouin等人通過在培養基中添加拮抗劑500μM?ketamine以保護過表達NR1和NR2亞基的HEK293細胞(Thouin?A,Gastaldi?M,?Woodhall?M,et?al.Comparison?of?N-methyl-D-aspartatereceptor?antibody?assays?using?live?or?fixed?substrates[J].Journal?ofNeurology,2021,268(5):1818-1826)。雖然拮抗劑的加入會改善靶細胞的死亡情況，但是拮抗劑過多會造成細胞毒性，降低過表達蛋白的表達量；過少則達不到改善細胞死亡的效果，熒光染色時“球狀”信號偏多，對結果的正常判斷造成干擾。

自2012年Gleichman等人發現抗NMDAR患者中的自身抗體主要識別?GluN1的N368/G369區域后，過表達NMDAR單亞基GluN1的HEK293細胞被用來檢測患者樣本中NMDAR自身抗體，但仍有不少學者持續比較不同方法檢出情況與臨床信息的一致性。歐蒙的一項研究結果是商業化的單亞基檢測系統雖然特異度為99％，但其在血清和腦脊液中的檢測靈敏度分別是?86％和92％，其高特異度是以降低檢測的靈敏度為代價的，相對于GluN1單亞基的檢測系統，NR1和NR2亞基檢測系統的檢出率略高。因此，有必要建立一套簡單、穩定、靈敏度高的過表達NMDARNR1和NR2雙亞基系統以輔助當前NMDAR腦炎患者樣本中自身抗體的檢測。

發明內容