[發明專利]一種特異性檢測蛭弧菌數量的絕對定量PCR引物及檢測方法

在審

• 申請號: 202210607051.5
• 申請日: 2022-05-31
• 公開（公告）號: CN114807402A
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發明（設計）人: 楊輝;張瑩瑩;季通偉;江逸楠
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 劉艷艷

本發明公開了一種特異性檢測蛭弧菌數量的絕對定量PCR引物及檢測方法，包括特異性引物；檢測方法包括：提取待測樣品的DNA；通過特異性引物對提取的待測樣品DNA進行PCR擴增；對PCR擴增后的產物進行純化；將純化后的DNA與載體進行連接擴培，制得重組質粒；對重組質粒進行提取，并進行濃度測定；將提取的重組質粒進行倍比稀釋，制得重組質粒標準模板；將特異性引物加入到重組質粒標準模板中，進行熒光定量PCR檢測，建立CT值與拷貝數之間的轉換關系；將特異性引物加入到需要檢測的樣品中，進行熒光定量PCR檢測，測定樣品的CT值，根據CT值與拷貝數之間的轉換關系，得出拷貝數。本發明能夠準確檢測出蛭弧菌，并且檢測過程簡單易操作。

技術領域

本發明屬于功能陶瓷材料技術領域，涉及一種特異性檢測蛭弧菌數量的絕對定量PCR引物及檢測方法。

背景技術

細菌性疾病一直給水產養殖業造成巨大的經濟損失。細菌性疾病不僅會造成水產動物的大量死亡，還會誘導病毒性疾病的爆發，導致大規模水產動物疫病，嚴重阻遏水產養殖業的發展。目前防治細菌性致病菌最常用的方法是抗生素，但是長期使用抗生素會導致細菌產生耐藥性。因此抗生素的有效替代品的研究，對于水產動物病害防控具有十分重要的作用。

在水產養殖業中無抗養殖的理念已經興起。相對于傳統的養殖過程中使用大量抗生素造成水環境污染和養殖動物體內抗生素的殘留，無抗養殖更加偏重于使用生物制劑進行病害的防控。蛭弧菌（Bdellovibrio）是一類專門寄生于其他細菌并能導致其裂解的革蘭氏陰性菌。蛭弧菌（Bdellovibrio）對所攻擊的宿主沒有特異性，其裂解普較寬，它們甚至能攻擊產生耐藥性的致病菌株。Bdellovibrio具有和噬菌體類似的功能，但不是病毒，而且抑菌的廣譜性比噬菌體更強。Bdellovibrio能穿透生物膜對深藏在生物膜內的致病菌進行攻擊，從而高效地控制生物膜內致病菌的繁殖，這也較好地解決了抗生素對生物膜內致病菌控制效果差的難題。

蛭弧菌制劑在現階段是使用較為廣泛的一種生物防控的制劑。蛭弧菌不但可以裂解水產養殖中的致病菌，同時還可以聯合其他有益菌通過拮抗等作用來凈化水體。蛭弧菌可以裂解細菌生物膜，消除了細菌生物膜對于抗生素的阻礙作用，使用生物劑型的蛭弧菌制劑來代替抗生素應用在未來成為可能，但市面上的蛭弧菌產品良莠不齊。目前噬菌蛭弧菌的檢測主要為雙平板計數噬菌斑，無法準確分辨蛭弧菌和快速簡便統計蛭弧菌培養數量。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種特異性檢測蛭弧菌數量的絕對定量PCR引物及檢測方法，能夠準確檢測出蛭弧菌，并且檢測過程簡單易操作。

為達到上述目的，本發明是采用下述技術方案實現的：

一方面，本發明提供了一種特異性檢測蛭弧菌數量的絕對定量PCR引物，包括特異性引物，所述特異性引物的序列為：

Bd-F上游引物：CAGGCCTAACACATGCAAGTC；

qBd-F上游引物：GTTTACGGCGTGGACTACC；

qBd-R下游引物：CGWCACTGAAGGGGTCAA。

另一方面，本發明提供了一種特異性檢測蛭弧菌數量的絕對定量PCR引物的檢測方法，包括以下步驟：

提取待測樣品的DNA；

通過特異性引物對提取的待測樣品DNA進行PCR擴增；

對PCR擴增后的產物進行純化；

將純化后的DNA與載體進行連接擴培，制得重組質粒；

對重組質粒進行提取，并進行濃度測定；

將提取的重組質粒進行倍比稀釋，制得重組質粒標準模板；

將特異性引物加入到重組質粒標準模板中，進行熒光定量PCR檢測，建立CT值與拷貝數之間的轉換關系；