[發明專利]帶有可視化蛋白融合抗生素篩選標記的CRISPR/Cas9載體及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202210606954.1
• 申請日: 2022-05-31
• 公開（公告）號: CN114807198A
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發明（設計）人: 吳寒;皮穎;李治飛
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/84;C12N15/54;C12N15/56;A01H6/82;A01H5/00
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 許婉靜

1.一種帶有可視化蛋白融合抗生素篩選標記的CRISPR/Cas9載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、以含有可視化蛋白的編碼基因和抗生素抗性基因的第一載體為模板，設計第一對引物，擴增所述可視化蛋白和抗生素抗性基因的核苷酸序列；以含有Cas9蛋白、Ubi啟動子和Nos終止子的核苷酸序列的第二載體為模板，設計第二對引物，擴增Ubi-Cas9-Nos核苷酸序列；

S2、使用第一限制性內切酶對第三載體進行酶切，去除抗生素抗性基因，使其線性化并回收片段，將回收的片段與步驟S1中擴增后的可視化蛋白和抗生素抗性基因的核苷酸序列進行Infusion連接，將連接產物轉化到第一感受態細胞中，挑取單克隆培養后進行測序，得到第四載體；

S3、使用第二限制性內切酶對所述第四載體進行酶切，使其線性化并回收片段，將回收的片段與步驟S1中擴增的Ubi-Cas9-Nos核苷酸序列進行Infusion連接，將連接產物轉化到第二感受態細胞中，挑取單克隆培養后進行測序，得到所述帶有可視化蛋白融合抗生素篩選標記的CRISPR/Cas9載體。

2.根據權利要求1所述的帶有可視化蛋白融合抗生素篩選標記的CRISPR/Cas9載體的構建方法，其特征在于，步驟S1中，所述可視化蛋白為β-葡糖苷酸酶，所述抗生素抗性基因為新霉素磷酸轉移酶基因。

3.根據權利要求2所述的帶有可視化蛋白融合抗生素篩選標記的CRISPR/Cas9載體的構建方法，其特征在于，所述第一載體為0380-GN載體，所述第一對引物的核苷酸序列如SEQID No.2和SEQ ID No.3所示。

4.根據權利要求1所述的帶有可視化蛋白融合抗生素篩選標記的CRISPR/Cas9載體的構建方法，其特征在于，所述第二載體為pYLCRISPR-Cas9Pubi-H載體，所述第二對引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示。

5.根據權利要求2所述的帶有可視化蛋白融合抗生素篩選標記的CRISPR/Cas9載體的構建方法，其特征在于，所述第三載體為pCAMBIA2300載體，所述第一限制性內切酶為XhoI，所述第二限制性內切酶為KpnI和EcoRI。

6.權利要求1～5任一項所述的構建方法構建的帶有可視化蛋白融合抗生素篩選標記的CRISPR/Cas9載體。

7.根據權利要求6所述的帶有可視化蛋白融合抗生素篩選標記的CRISPR/Cas9載體，其特征在于，所述帶有可視化蛋白融合抗生素篩選標記的CRISPR/Cas9載體的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

8.權利要求1～5任一項所述的構建方法構建的帶有可視化蛋白融合抗生素篩選標記的CRISPR/Cas9載體的應用，其特征在于，將所述帶有可視化蛋白融合抗生素篩選標記的CRISPR/Cas9載體用于構建基因編輯載體。

9.根據權利要求8所述的帶有可視化蛋白融合抗生素篩選標記的CRISPR/Cas9載體的應用，其特征在于，將所述帶有可視化蛋白融合抗生素篩選標記的CRISPR/Cas9載體用于構建番茄SlD14基因的基因編輯載體。

10.根據權利要求9所述的帶有可視化蛋白融合抗生素篩選標記的CRISPR/Cas9載體的應用，其特征在于，將所述帶有可視化蛋白融合抗生素篩選標記的CRISPR/Cas9載體用于構建番茄SlD14基因的基因編輯載體的方法包括以下步驟：

P1、在SlD14基因的外顯子上設計如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的2個靶序列；

P2、合成如SEQ ID No.9所示的sgRNA序列，將其插入到所述帶有可視化蛋白融合抗生素篩選標記的CRISPR/Cas9載體的SbfI和SmaI酶切位點之間，得到所述番茄SlD14基因的基因編輯載體；所述sgRNA序列包含AtU3d和AtU3b啟動子以及2個所述靶序列。