[發(fā)明專利]來源于腫瘤組織的具有腫瘤特異性殺傷效果的T淋巴細(xì)胞及其制備方法和細(xì)胞制劑

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• 申請日: 2022-05-30
• 公開（公告）號: CN114672457A
• 公開（公告）日: 2022-06-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馮春玲;陳曉波;韓顥;韓洪起;吳學(xué)濤
• 申請（專利權(quán)）人: 優(yōu)賽醫(yī)療科技（天津）有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 天津市尚儀知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 12217
• 代理人: 孫喬喬

本發(fā)明公開了一種來源于腫瘤組織的具有腫瘤特異性殺傷效果的T淋巴細(xì)胞及其制備方法和細(xì)胞制劑。本發(fā)明通過對腫瘤組織進(jìn)行消化分離，獲得的種子細(xì)胞，給予連續(xù)刺激并使用特定培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，在較短培養(yǎng)周期內(nèi)即可獲得滿足制劑需求的細(xì)胞數(shù)量并制成細(xì)胞懸液。本發(fā)明采用連續(xù)刺激加定向培養(yǎng)的擴(kuò)增方式，在細(xì)胞接種初始即給予刺激，相比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法先擴(kuò)增種子細(xì)胞數(shù)再刺激的方式，可大大提高細(xì)胞擴(kuò)增效率，縮短培養(yǎng)周期，使細(xì)胞維持高水平的生物活性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及T淋巴細(xì)胞制劑領(lǐng)域，特別涉及一種來源于腫瘤組織的具有腫瘤特異性殺傷效果的T淋巴細(xì)胞及其制備方法和細(xì)胞制劑。

背景技術(shù)

近幾年，隨著生物醫(yī)藥領(lǐng)域的迅猛發(fā)展，免疫療法逐漸成為繼手術(shù)、放療、化療后第四類腫瘤治療手段，其中過繼性細(xì)胞治療、免疫檢查點阻斷療法、腫瘤疫苗以及雙特異性抗體等治療方法均取得了一定的臨床療效。然而在實體瘤發(fā)展過程中，實體腫瘤的物理屏障及其復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境限制了非特異性免疫治療的療效。

來自腫瘤內(nèi)部或腫瘤組織附近的腫瘤組織浸潤性淋巴細(xì)胞，對腫瘤細(xì)胞具有特異性識別能力，在1922年首次被提到，Mac carty推測淋巴細(xì)胞到腫瘤組織內(nèi)是體內(nèi)免疫系統(tǒng)抵抗腫瘤的一種現(xiàn)象，提出了腫瘤組織浸潤性淋巴細(xì)胞是一種高效抗癌的免疫效應(yīng)細(xì)胞。1986年Rosenberg等人在荷瘤小鼠的腫瘤組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分離出了腫瘤組織浸潤性淋巴細(xì)胞，他們將分離出的細(xì)胞經(jīng)過體外擴(kuò)增培養(yǎng)后，再回輸?shù)胶闪鲂∈篌w內(nèi)，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織有明顯消退，從而證明腫瘤組織浸潤性淋巴細(xì)胞具有抗腫瘤的作用。

常規(guī)的腫瘤特異性殺傷T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)方法，多采用兩步法進(jìn)行培養(yǎng)，先用高濃度的IL-2擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量，再用CD3單抗、CD28單抗或輻照的人外周血PBMC等對細(xì)胞進(jìn)行刺激以提高效應(yīng)細(xì)胞的比例，培養(yǎng)周期通常在20-25天，也有研究培養(yǎng)到36天，此方法最后收獲的細(xì)胞，往往生物活性均有所降低，并且最終制劑中含有較高比例的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞，嚴(yán)重影響臨床治療效果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了解決上述技術(shù)問題，提供了一種來源于腫瘤組織的具有腫瘤特異性殺傷效果的T淋巴細(xì)胞及其制備方法和細(xì)胞制劑。

第一方面，本發(fā)明提供一種來源于腫瘤組織的具有腫瘤特異性殺傷效果的T淋巴細(xì)胞的制備方法，是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的。

一種來源于腫瘤組織的具有腫瘤特異性殺傷效果的T淋巴細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

S1.將腫瘤組織進(jìn)行清洗、分割，放入消化液中震蕩消化30-40min；

S2.組織消化后過濾、洗滌、離心，用T淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸沉淀后加入到預(yù)先包被的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加IFN-γ至終濃度1000-1500IU/ml，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；所述包被的培養(yǎng)瓶的方法為：用含有CD3和CD28單抗的T淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基包被培養(yǎng)瓶置于37℃，5.0% CO₂條件下0.5-1h；

S3.每日觀察細(xì)胞狀態(tài)，取樣計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果補(bǔ)加T淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度在0.5-0.8×10⁹/L，繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)；

S4.繼續(xù)每日觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)培養(yǎng)體系達(dá)到10-15ml時，取樣計數(shù)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至預(yù)先包被的培養(yǎng)瓶中，包被方法同步驟S2；根據(jù)計數(shù)結(jié)果補(bǔ)加T淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度在0.5-0.8×10⁹/L，補(bǔ)加IFN-γ至終濃度1000-1500IU/ml，繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)；

S5.繼續(xù)每日觀察細(xì)胞狀態(tài)，取樣計數(shù)，當(dāng)培養(yǎng)體系達(dá)到25-45ml時，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)瓶中，根據(jù)計數(shù)結(jié)果補(bǔ)加T淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度在0.5-0.8×10⁹/L，繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)；

S6.繼續(xù)每日觀察細(xì)胞狀態(tài)，取樣計數(shù)，當(dāng)培養(yǎng)體系達(dá)到180-200ml時，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)袋中，按照20-50ng/ml向培養(yǎng)袋中補(bǔ)加CD3和CD28單抗，根據(jù)計數(shù)結(jié)果補(bǔ)加T淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度在0.5-0.8×10⁹/L，繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)；