[發明專利]一組GH10家族木聚糖酶的N-糖基化突變體及其應用

在審

• 申請號: 202210588930.8
• 申請日: 2022-05-26
• 公開（公告）號: CN114854724A
• 公開（公告）日: 2022-08-05
• 發明（設計）人: 王俊;查子千;游帥;張溫馨;張伊欣;盧宇
• 申請（專利權）人: 江蘇科技大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;C12P19/02;C12P19/14;C12R1/84
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 唐循文

一組GH10家族木聚糖酶的N?糖基化突變體及其應用，對位于Loop區N141?N153且處于GH10家族木聚糖酶基因序列保守區的相同氨基酸位點N147和A142進行定點突變，所述突變位點以4XX6為模板的N147位點，獲得木聚糖酶突變體4XX6?N147Q；以XYL10C?N為模板的A142位點，獲得木聚糖酶突變體XYL10C?N?A142N；其中木聚糖酶突變體4XX6?N147Q的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；木聚糖酶突變體XYL10C?N?A142N的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。綜合分析發現Ala142位點構建的N?糖基化具有促進GH10家族木聚糖酶熱穩定性的作用。本發明對利用N?糖基化改良GH10家族木聚糖酶的熱穩定性具有重要的指導意義。

技術領域

本發明涉及基因工程、蛋白質工程領域，具體涉及一組GH10家族木聚糖酶的N-糖基化突變體及其應用。

背景技術

纖維素類物質包括纖維素、半纖維素和木質素，是自然界中常見的、最豐富的可再生資源。木聚糖是半纖維素中含量最高的多糖，廣泛存在于在農業副產物如玉米芯、麥麩和甘蔗渣等中。木聚糖酶被廣泛應用于降解木聚糖以促進半纖維素的應用。

木聚糖酶存在于很多家族中，其中，GH10家族的木聚糖酶是一種具有真正嚴格意義上的內切-1,4-β-木聚糖酶的催化活性和催化結構域。木聚糖酶被應用于造紙行業以減少污染和降低漂白過程中漂白劑的使用量。其還是木質纖維素類生物質糖化為生物燃料生物乙醇的關鍵酶。木聚糖酶被廣泛應用于降解木聚糖，但是其熱穩定性的劣勢限制了應用價值。

N-糖基化是真核細胞中最常見的翻譯后修飾方法之一，其是新生肽鏈的共翻譯或翻譯后修飾方法，特征序列為N-X-S/T，其中X不為P。其會影響蛋白質的生物學功能，如蛋白質折疊、細胞識別等，從而影響酶的活性、熱穩定性和分泌效率。因此，基于N-糖基化的理論和構建方法，通過理性或半理性的分析方式，在重組酶的特定位點引入或去除N-糖基化可以改善重組酶的熱穩定性等酶學性質。

針對生物質降解和造紙業等工業的需求，改良木聚糖酶的熱穩定性仍具有重大意義。

發明內容

解決的技術問題：本發明提供了一組GH10家族木聚糖酶的N-糖基化突變體的構建方法與應用，該突變體為通過N-糖基化改造后篩選獲得。去除N-糖基化的突變體4XX6-N147Q在80℃下的半衰期為19min，是野生型4XX6的0.56倍；引入N-糖基化的突變體XYL10CΔN-A142N在85℃下的半衰期為18min，是野生型XYL10CΔN的2.76倍，且能在偏酸性條件下具有80％以上的酶活力。

技術方案：一組GH10家族木聚糖酶的N-糖基化突變體，對位于Loop區N141-N153且處于GH10家族木聚糖酶基因序列保守區的相同氨基酸位點N147和A142進行定點突變，所述突變位點以4XX6為模板的N147位點，獲得木聚糖酶突變體4XX6-N147Q；以XYL10CΔN為模板的A142位點，獲得木聚糖酶突變體XYL10CΔN-A142N；其中木聚糖酶突變體4XX6-N147Q的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；木聚糖酶突變體XYL10CΔN-A142N的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

編碼木聚糖酶突變體4XX6-N147Q的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

編碼木聚糖酶突變體XYL10CΔN-A142N的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示核苷酸的質粒。

一種重組載體，含有上述質粒。

一種重組菌株，表達上述重組載體。

上述生物材料在降解木聚糖中的應用。

上述重組菌株的構建方法，包括以下步驟：