[發明專利]纖維素酶表達和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株及其構建與應用

有效

• 申請號: 202210581356.3
• 申請日: 2022-05-26
• 公開（公告）號: CN114806903B
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發明（設計）人: 鐘耀華;沈林靜;錢遠超;劉紅
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/113;C12N15/80;C12N15/66;C12N9/42;C12P19/02;C12P19/14;C12R1/885
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

本發明公開了一種纖維素酶表達和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株QCDS，該菌株是以里氏木霉QEB4為出發菌株，在其基因組中構建了含有以組成型啟動子Pcdna1表達的xyr1基因即xyr1過表達盒，其核酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，同時含有以纖維素誘導型啟動子Pegl2表達的sec63基因即sec63過表達盒，其核酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本發明還公開了所述菌株在發酵生產纖維素酶中的應用和所述菌株發酵產物纖維素酶液在水解生物質材料提升糖化后葡萄糖釋放量中的應用。實驗證實本發明的工程菌株纖維素酶表達和分泌能力均顯著提升，纖維素酶活力達到27.1IU/mL，在纖維素酶生產和用于木質纖維素生物質材料的降解中具有良好的工業開發和應用前景。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種纖維素酶表達和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株及其構建方法與應用。

背景技術

木質纖維素類生物質作為地球上最為豐富的可再生資源之一，在新能源的開發過程中有著非常廣闊的應用前景。然而，纖維素酶的高生產成本一直是限制這類生物質轉化的主要障礙。絲狀真菌里氏木霉是當前纖維素酶的主要工業生產菌株，其生產的纖維素酶廣泛應用于能源、紡織等領域。然而，其產量仍然無法滿足工業需求，因此亟需進一步提升里氏木霉的纖維素酶產量。

目前用來提升纖維素酶產量的方法主要有：菌株誘變、發酵工藝優化，以及利用基因工程技術構建工程菌株等；其中通過基因工程技術改造里氏木霉基因組從而實現纖維素酶的高水平表達和分泌是降低纖維素酶高生產成本的重要手段。作為里氏木霉主要的分泌蛋白，纖維素酶的生產受到基因轉錄、蛋白翻譯、翻譯后修飾到蛋白分泌等不同層次的復雜調控。里氏木霉具有復雜的纖維素酶轉錄調控網絡，目前已發現了至少四個轉錄激活因子(Xyr1、Ace2、Ace3和Hap2/3/5復合體)以及三種轉錄抑制因子(Ace1、Cre1、Rce1)，這些轉錄因子在纖維素酶基因的表達中發揮重要功能。此外，纖維素酶在分泌過程中需要經過在內質網中的一系列蛋白折疊與分選過程，包括蛋白轉運(Sec61、Sec63等)、蛋白折疊(Bip1、Pdi1等)和糖基化過程(Gls1、Gls2)等。通過對控制里氏木霉纖維素酶轉錄表達和分泌的轉錄調控網絡和分泌途徑進行改造，有望能實現纖維素酶的高效生產。然而目前所應用的基因工程手段往往局限于單一方面，這限制了里氏木霉的纖維素酶生產潛能挖掘。經檢索，有關在提升纖維素酶的工程方法中對于同時改造轉錄水平(如Xyr1等轉錄激活因子)和分泌過程(如關鍵分泌元件Sec63等)的文獻或技術方案以及相關纖維素酶表達和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株及其構建方法與應用目前尚無報道。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種纖維素酶表達和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株及其構建方法與應用。

本發明所述纖維素酶表達和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株，其特征在于：所述菌株命名為QCDS，該菌株是以里氏木霉QEB4為出發菌株，在其基因組中構建了含有以組成型啟動子Pcdna1表達的xyr1基因即xyr1過表達盒，其核酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，同時含有以纖維素誘導型啟動子Pegl2表達的sec63基因即sec63過表達盒，其核酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；其中xyr1基因被整合到hph位點上，該xyr1基因的上游為啟動子Pcdna1，下游為xyr1本源的終止子，抗性基因ptrA位于上游同源臂和啟動子Pcdna1之間；sec63基因上游為啟動子Pcdna1，下游為sec63本源的終止子。

上述纖維素酶表達和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株的構建方法，步驟是：