[發明專利]用于檢測水稻細菌性谷枯病菌的組合產品及試劑盒

在審

• 申請號: 202210578688.6
• 申請日: 2022-05-25
• 公開（公告）號: CN114958835A
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 田茜;羅來鑫;趙文軍;方雪陽;馬云龍;孫羽佳
• 申請（專利權）人: 三亞中國檢科院生物安全中心;中國檢驗檢疫科學研究院;中國農業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/689;C12Q1/6844;C12R1/01
• 代理公司: 北京市中倫律師事務所 11410
• 代理人: 信建

本發明涉及分子生物學技術領域，具體而言，涉及一種用于檢測水稻細菌性谷枯病菌的組合產品及試劑盒。該組合產品包括上游引物、下游引物和探針，可配合等溫核酸擴增體系進行使用。本發明所提供的組合產品及試劑盒檢測靈敏度和特異性均較高，且檢測方便，耗時較短。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體而言，涉及一種用于檢測水稻細菌性谷枯病菌的組合產品及試劑盒。

背景技術

水稻細菌性谷枯病菌是黃單胞屬的革蘭氏陰性細菌，是引起水稻細菌性谷枯病(bacterial panicle blight ofrice,BPBR)的病原菌，該病害最早在日本發現，目前蔓延至東南亞，美洲，非洲部分地區，(CABI)。國內2007年首次在無癥狀谷粒中檢出水稻細菌性谷枯病菌(J.Luo et.al.,2007)，2020年首次在南方稻田有癥狀病葉中檢出水稻細菌性谷枯病菌(Y.Hou et.al.,2020)，目前該病害在國內呈零星分布。在田間接種試驗中細菌性谷枯病可導致高達75％產量損失；一項美國的研究中證明，隨著全球變暖，細菌性谷枯病侵染面積將增大，導致減產增多，在3℃升溫下，水稻細菌性谷枯病預計額外造成每年2.04億美元損失(Shew AM et.al.,2019)。水稻細菌性谷枯病菌嚴重威脅到糧食安全，因此將其列入我國的進境植物檢疫性有害生物，快速準確的檢疫檢測技術能有效阻止其傳播，保證稻谷安全生產。

目前對于水稻細菌性谷枯病菌的檢測主要是傳統的生物測定，直接分離以及分子檢測的多聚酶鏈式反應(PCR)方法實時熒光PCR(qRT-PCR)方法和血清學方法，但PCR和ELISA方法靈敏度有限，且耗時較長，qRT-PCR依賴昂貴的檢測儀器并對環境中的抑制因素和污染較為敏感，容易有假陽性或假陰性。

重組酶聚合酶擴增技術(RPA)技術是2006年提出的一種新型多酶恒溫核酸擴增技術，可以快速且便捷地進行核酸檢測分析(Piepenburg et al.,2006)。在25-43℃的恒溫條件下，RPA技術能在5-20min內實現特定核酸序列的擴增并觀察到結果。本實驗采用的是改進的RPA技術稱為多酶恒溫核酸快速擴增技術(MIRA)，具有更好的穩定性和相同時間更高的熒光值(Hui Chenet al.,2021)。

發明內容

本發明的第一目的在于提供一種組合產品，包含：

上游引物：TCGCTCTCCCGAGGGAGATGACAGCCGCTACA；

下游引物：ACACGGAACACCTGGGTAGTCTCTGTAGGGAAG；以及

探針：CCATCTCAAATAAGCGCTTCCGCTATCCACTXTACTACTTCT TCCAGAT；

其中所述探針為基于重組酶聚合酶擴增技術的探針，第31位堿基T標記發光基團，第32位X為脫堿基核苷酸類似物，第33位堿基T標記淬滅基團，3’端進行阻斷劑修飾；所述阻斷劑用于阻斷探針的聚合酶延伸。

本發明的第二目的在于提供試劑盒，其包含如上所述的組合產品。

本發明的第三目的在于提供如上所述的組合產品，或如上所述的試劑盒在檢測水稻細菌性谷枯病菌中的應用。

本發明所提供的組合產品及試劑盒用于檢測水稻細菌性谷枯病菌，檢測靈敏度和特異性均較高，且檢測方便，耗時較短。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1～圖6為本發明一個實施例對伯克氏菌屬的不同植物病原菌檢測的結果；