[發明專利]rAAV重組包裝質粒、用于rAAV包裝的質粒系統和rAAV的制備方法

在審

• 申請號: 202210568364.4
• 申請日: 2022-05-24
• 公開（公告）號: CN114657153A
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 馮煒;劉汪;莊露;闞子義;羅順
• 申請（專利權）人: 上海健士拜生物科技有限公司;澳斯康生物（南通）股份有限公司;甘肅健順生物科技有限公司;健順生物科技（南通）有限公司;上海澳斯康生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/864;C12N15/66;C12N5/10
• 代理公司: 華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 王秉麗

1.一種rAAV的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟：用質粒產品轉染包裝細胞，培養，收集rAAV；

所述質粒產品包括：含兩個末端反向重復序列的質粒、腺病毒輔助質粒和rAAV重組包裝質粒；

所述rAAV重組包裝質粒包含pAAV-RC質粒，以及插入所述pAAV-RC質粒的P5啟動子、真核啟動子和mir342基因，所述P5啟動子位于所述pAAV-RC質粒所含rep基因的上游，用于調控rep基因的表達，所述真核啟動子位于所述mir342基因的上游，用于調控所述mir342基因的表達。

2.根據權利要求1所述的rAAV的制備方法，其特征在于，所述P5啟動子位于所述pAAV-RC質粒第1個堿基至第481個堿基之間或者第7004個堿基至第7350堿基之間。

3.根據權利要求1所述的rAAV的制備方法，其特征在于，所述真核啟動子為CMV、EF1a、CAG或者SV40。

4.根據權利要求1至3任一項所述的rAAV的制備方法，其特征在于，所述rAAV重組包裝質粒的構建方法包括在pAAV-RC質粒中插入所述P5啟動子、所述真核啟動子和所述mir342基因的步驟。

5.根據權利要求4所述的rAAV的制備方法，其特征在于，在所述pAAV-RC質粒中插入所述P5啟動子、所述真核啟動子和所述mir342基因的步驟包括：

用Hpa I酶和Eag I酶酶切所述pAAV-RC質粒，制備酶切產物Ⅰ；

在所述P5啟動子的兩端添加Hpa I酶和Eag I酶的酶切位點片段，用Hpa I酶和Eag I酶進行雙酶切，制備酶切產物Ⅱ；

用連接酶連接所述酶切產物Ⅰ和所述酶切產物Ⅱ，制備重組質粒pAAV-P5-RC；

用Xma I酶和SnaB I酶雙酶切所述pAAV-P5-RC，制備酶切產物Ⅲ；

提供包含所述真核啟動子和所述mir342基因的連接片段，在所述連接片段的兩端添加Xma I酶和SnaB I酶的酶切位點片段，用Xma I酶和SnaB I酶進行雙酶切，制備酶切產物Ⅳ；

用連接酶連接所述酶切產物Ⅲ和所述酶切產物Ⅳ，制備所述rAAV重組包裝質粒。

6.根據權利要求5所述的rAAV的制備方法，其特征在于，所述Hpa I酶的酶切位點片段添加在所述P5啟動子的5’端，所述Eag I酶的酶切位點片段添加在所述P5啟動子的3’端。

7.根據權利要求5所述的rAAV的制備方法，其特征在于，所述Xma I酶的酶切位點片段添加在所述連接片段的3’端，所述SnaB I酶的酶切位點片段添加在所述連接片段的5’端。

8.根據權利要求1至3以及5至7任一項所述的rAAV的制備方法，其特征在于，所述含兩個末端反向重復序列的質粒為pAAV-MCS質粒。

9.根據權利要求1至3以及5至7任一項所述的rAAV的制備方法，其特征在于，所述含兩個末端反向重復序列的質粒還包含GOI。

10.根據權利要求1至3以及5至7任一項所述的rAAV的制備方法，其特征在于，所述包裝細胞選自HEK293、HEK293T和HEK293F、HEK293A、Hela、Vero和CHO中的一種或者多種；或/和，培養的條件包括：CO₂含量為4.5%-5.5%（v/v）的氣體環境，溫度為36.5℃-37.5℃，時間為48小時-96小時。