[發明專利]磷脂脫除劑及其在生物樣品脫磷脂中的應用

有效

• 申請號: 202210550293.5
• 申請日: 2022-05-20
• 公開（公告）號: CN114755355B
• 公開（公告）日: 2023-06-16
• 發明（設計）人: 謝非凡;柳蘭玉
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/02;G01N30/14;G01N30/34;G01N30/72;G01N30/86;G01N30/88
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所(普通合伙) 43114
• 代理人: 盛武生

本發明屬于生物樣品處理以及測定領域，具體涉及一種磷脂脫除劑，包含成分A和成分B；所述的成分A包含葡聚糖鹽、堿化的膠體二氧化硅中的至少一種；所述的成分B包含鑭源、鋯源中的至少一種。本發明還提供利用所述的磷脂脫除劑進行生物樣品脫磷脂以及測定方法。本發明研究表明，采用所述的成分A和成分B聯合，能夠實現協同，能夠克服生物樣品中磷脂識別脫除率低的問題，此外，對生物樣品中的不同類別的磷脂具有普適性，可以有效脫除生物樣品中的各類磷脂。

技術領域

本發明涉及分析檢測技術領域，尤其涉及生物樣本前處理領域。

技術背景

高效液相色譜-串聯質譜(Liquid?chromatography-tandem?mass?spectrometry,LC-MS/MS)技術是目前生物樣品中藥物及其代謝物分析的主流方法。但是，LC-MS/MS用于生物樣品分析極易產生基質效應，基質效應的發生會導致待測組分的離子化效率發生變化，直接影響生物樣品定量分析結果的可靠性，成為LC-MS/MS技術用于生物樣品定量分析中最突出的問題之一。磷脂被證明是導致基質效應發生的主要成分，它能夠嚴重抑制許多化合物的質譜響應，且通過傳統的樣本處理方法很難將其從生物樣品中去除。磷脂作為細胞膜的主要成分，在各種類型的生物樣品中(如血漿和組織等)都含量顯著。比如，人血漿中磷脂總濃度高達1.6-3.0mg/mL。磷脂依其主鏈結構可分為甘油磷脂(Phosphoglyceride)和鞘磷脂(Sphingomyelin,SM，約占總磷脂的15％)。前者主要包括磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine,PC)、溶血磷脂酰膽堿(Lysophosphatidylcholine,Lyso-PC)和磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)等，PC和Lyso-PC分別占總磷脂量的70％和10％。改善樣品的前處理過程，盡可能地減少最終提取液中的磷脂，才能從根源上消除基質效應。

目前，LC-MS/MS生物分析中最常用的樣品前處理方法主要包括：

1、蛋白沉淀法(PPT)：PPT是應用最早、耗時最少、被廣泛應用于生物分析的樣品前處理方法，具有簡單、快速、經濟的特點，是常用甚至首選的樣品前處理方法。生物樣品如血樣在LC-MS/MS分析測定之前，必須首先進行去蛋白處理。通過加入蛋白沉淀劑(如甲醇和乙腈)，使蛋白質變性，然后再渦旋、離心，形成蛋白沉淀和上清液，分離的上清液可直接進樣或經稀釋后進樣檢測。

2、液液萃取法(LLE)：LLE是采用與水不相溶的有機溶劑(如乙酸乙酯)，將目標分析物從水相提取至有機相的方法。進行LLE處理包括加有機溶劑、渦旋混合、離心、吹干、復溶等基本步驟，操作時需要根據分析物的性質，考慮有機溶劑的特性、溶劑體積及pH對提取效果的影響，樣品處理時宜選擇對分析物溶解度大，沸點低，易濃縮，與水不相溶，無毒，穩定，不易乳化的有機溶劑。

3、固相萃取法(SPE)：SPE基于樣品基質各種組分不同的分配系數，使目標分析物保留并洗脫下來，同時選擇性地去除樣品基質中的雜質(干擾物)。SPE利用萃取小柱或96-微孔板，填裝不同類型的固相吸附填料，實現不同的分離模式(反相、正相和離子交換等)，選擇性保留分析物而使干擾物流出，或者反之，從而達到凈化樣品的目的。

由于磷脂類化合物為兩性分子，分子結構一端是堿取代基團構成的親水頭，另一端為脂肪酸鏈構成的疏水尾。傳統的生物樣品處理方法如蛋白質沉淀、液液萃取和固相萃取，都難以有效去除樣品中的磷脂成分。PPT僅可去除蛋白質，不能去除磷脂，因此最容易產生明顯的基質效應。LLE可去除樣品中的部分磷脂，但仍有大量磷脂因其較強的疏水脂肪酸鏈而與分析物共提取，且LLE過程相對繁瑣，對極性化合物提取回收率低。SPE雖可選擇性地提取洗脫分析物，但依然無法高效去除磷脂成分，且SPE價格高昂、處理過程繁瑣。

發明內容

針對現有生物樣品磷脂脫除手段存在脫除普適性不理想、脫除率不高的問題，本發明的第一目的在于，提供一種磷脂脫除劑，旨在通過成分的協同，改善生物樣品磷脂脫除普適性以及脫除率。