[發明專利]鐵缺乏小鼠小腸類器官模型的構建方法及應用

在審

• 申請號: 202210549875.1
• 申請日: 2022-05-20
• 公開（公告）號: CN115125186A
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發明（設計）人: 杜華華;田晨映;趙婧
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/02
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

本發明公開了鐵缺乏小鼠小腸類器官模型的構建方法及應用。在小鼠小腸類器官培養基中加入500μM的鐵螯合劑DFO試劑，混勻靜置培養48h后實現體外鐵缺乏小鼠腸道類器官模型的構建。構建的體外鐵缺乏小鼠小腸類器官模型，可用于探究鐵缺乏對腸道干細胞增殖分化的影響及其作用機制，可用于研究鐵缺乏對腸道健康的影響和藥物篩選。

技術領域

本發明屬于生物醫學技術領域，特別是涉及鐵螯合劑DFO構建鐵缺乏小鼠小腸類器官模型的方法及應用。

背景技術

缺鐵是造成全球疾病負擔的主要因素之一，是全球疾病和健康的重要挑戰。對兒童和孕婦的影響尤其顯著。除此之外，在畜禽生產中，初生仔豬容易出現缺鐵性貧血，初生仔豬體組織鐵含量低，母豬初乳與常乳中鐵含量不能滿足仔豬快速生長發育的需求，且仔豬胃酸分泌較少，對鐵吸收的促進作用較弱，因此仔豬容易罹患缺鐵性貧血。鐵缺乏的仔豬會出現皮膚蒼白、食欲減退、生長發育遲緩等癥狀，會對畜牧生產帶來極大的損失。除此之外，缺鐵已經證明與多種疾病相關，如缺鐵性貧血、炎癥性腸病、神經功能障礙、胎兒生長遲緩、不寧腿綜合征等。

腸道是全身上下最大的吸收場所和免疫器官，對機體的生長發育至關重要。腸道類器官指的是由腸道隱窩或干細胞在3D培養條件下生成的具有腸上皮結構和功能的類似于花環狀的囊狀細胞團，能在體外模擬體內腸道的自我更新，又稱為“mini-gut （迷你腸道）”。其中小腸腸道類器官英文為enteroid，結腸腸道類器官英文為colonoid。機體鐵代謝與腸道健康與發育密切相關，鐵缺乏對腸道的影響主要聚焦在腸道屏障與腸上皮細胞的相關研究方面，但對腸道干細胞增殖分化的影響相關研究未見報道。如果有方法可以建立起正常生理條件下腸道鐵缺乏的模型，那么將為后續研究鐵缺乏對腸道干細胞生長發育奠定基礎，有助于進一步研究鐵缺乏在正常生理條件下在腸道的作用機制，對后續鐵缺乏的生理生化研究有重要意義。

目前仍沒有方法可以系統建立體外小腸類器官鐵缺乏的細胞模型，所以當前生物醫藥領域亟需一種可以穩定、高效、全面、便捷建立鐵缺乏小腸類器官的方法。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的目的是提供鐵缺乏小鼠小腸類器官模型的構建方法及應用。

一種鐵缺乏小鼠小腸類器官模型的構建方法，包括：

步驟一，首先是小鼠小腸類器官的獲取，小鼠安樂死后用75%的酒精給小鼠腹部擦拭消毒，用手術剪剪開小鼠腹部皮膚及腹膜，剪取15 cm的小腸腸段，放入預冷的PBS緩沖液中，祛除小腸腸段上的腸系膜與脂肪；

步驟二，用注射器吸取PBS溶液沖洗腸道中的食糜，棄廢液，在PBS溶液中縱向剪開腸道，暴露腸絨毛，用冰PBS溶液清洗腸道直至PBS溶液澄清；

步驟三，1 mL的0.5 M EDTA溶液加到25 mL 的冰PBS中配成1 mM EDTA溶液，將腸段剪成2~5 mm的小段，放入配好的EDTA溶液中，在搖床上輕晃使腸段剛好完全搖晃起來，30min；

步驟四，搖晃結束后，棄掉廢液，吸盡EDTA溶液，加入25 mL冰PBS溶液，輕柔顛倒混勻數次后靜置，隨后棄掉廢液，小心吸盡PBS溶液后將腸段倒入干凈的培養皿中，吸盡多余的PBS溶液，將腸段集中擺放，加入5 mL的冰PBS溶液反復吹打腸段，使隱窩和絨毛分離；

步驟五，在50 mL離心管口裝上70 μm細胞濾網，將上步驟四中吹打均勻的混合液通過70 μm細胞濾網以去除多余的絨毛；

步驟六，取500 μL步驟五中過濾后的混合液加于新的離心管中，于掌上離心機離心5 min。棄上清，以小腸類器官培養基：Matrigel = 1:1 的比例，將隱窩小心吹打重懸，不要有氣泡；

步驟七，拿出預熱的48孔細胞培養板，每孔加入30 μL步驟六中的重懸液，形成立體的液滴，