[發明專利]一種基于非干涉合成孔徑的光強傳輸衍射層析顯微成像方法

在審

• 申請號: 202210545129.5
• 申請日: 2022-05-19
• 公開（公告）號: CN114965470A
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 左超;周順;李加基;陳錢;孫佳嵩;白治東;周寧;盧林芃
• 申請（專利權）人: 南京理工大學
• 主分類號: G01N21/84
• 分類號: G01N21/84;G01N21/01
• 代理公司: 南京理工大學專利中心 32203
• 代理人: 岑丹

本發明公開了一種基于非干涉合成孔徑的光強傳輸衍射層析顯微成像方法，通過采集不同照角度下的軸向離焦強度堆棧，在光強頻譜上執行半空間傅里葉濾波或等效的三維希爾伯特變換，結合非干涉合成孔徑，從而實現了基于非干涉測量下無需滿足匹配照明條件的衍射層析成像。由于固有的合成孔徑優勢，使得成像分辨率達到非相干成像衍射極限，獲得了高分辨率成像結果。采用非干涉測量，成像光路簡單，光學路徑穩定，成像結果不受散斑和寄生干涉影響，并且可高度兼容傳統明場顯微鏡結構。

技術領域

本發明屬于光學顯微測量、三維折射率成像技術，特別是一種基于非干涉合成孔徑的光強傳輸衍射層析顯微成像方法。

背景技術

在生物醫學顯微成像領域，大部分活細胞和未染色的生物標本都是無色透明的，這是因為細胞內各部分細微結構的折射率和厚度不同，當光波通過時，波長和振幅并不發生變化，僅相位發生變化，但這種相位差人眼無法觀察。這就需要通過一些化學或者生物手段來對細胞進行染色或標記，從而使其在顯微鏡下可見。在過去的幾十年里，開發了多種熒光顯微成像方式，如寬場、共聚焦、全內反射熒光、雙/多光子和光片熒光顯微鏡技術，它們被作為探測非常微弱的信號和揭示固定或活細胞的三維結構和功能特性的強大工具，具有很高的特異性。在這些技術中，附著在特定分子結構上的熒光標記物被短波長激光激發后輻射出長波長熒光，從而可對原本透明的生物樣本進行成像。進入21世紀以來，超分辨熒光顯微技術突破了衍射極限,將成像分辨率提升至幾十納米，為亞細胞尺度的研究提供了技術手段。目前的超分辨熒光顯微成像方法有受激發射損耗顯微成像(STED)、結構光照明顯微術(SIM)、隨機光學重建顯微術(STORM)以及光激活定位顯微術(PLAM)等。然而，這些技術不適合成像非熒光樣品，或可視化不能被熒光分子標記的細胞成分，從而限制了熒光顯微技術的應用范圍。此外，外源性熒光劑帶來的光毒性可能會對細胞活性等細胞功能產生不可逆的負面影響，而相關的光漂白性會在一段較長的時間內阻止活細胞長時間成像。

近年來，為了簡化樣本制備過程、消除熒光分子對待測樣品的干擾并滿足臨床的成像需求，無標記光學成像成為了生物醫學顯微成像研究的熱點，相襯顯微鏡利用折射率作為本征光學成像對比度，在不使用外源性標記劑的情況下對生物樣品進行無標記成像。其中二維無標記成像，測得的數據只是待測物體沿軸向的光吸收或光程差積累，反映樣品信息的折射率與厚度信息相互耦合，無法得到三維信息。為了獲得更準確的形態學信息，如體積、形狀、干質量等，生物樣本的無標記三維成像成為目前研究的一大熱門方向。

光學全息術的引入使得測量由樣品引起的微小相位差成為可能，促進了相位成像技術從定性觀察到定量測量的發展。將光學全息術與計算機斷層掃描相結合，通過物體旋轉或照明掃描，目前已經開發出了各種光學衍射層析成像方法用以推斷生物樣品的三維折射率分布。特別是光學衍射層析使三維無標記顯微鏡成為可能，并已成功應用于研究血細胞、神經元細胞、癌細胞、細菌等各種類型的生物樣品。然而，基于干涉的光學衍射層析通常使用時間相干照明光源，使得成像結果中存在散斑噪聲，阻礙了高質量圖像的形成。此外，它們大多數都需要采用具有復雜光束掃描裝置的干涉裝置，這妨礙了它們在生物和醫學領域的廣泛應用。

為了彌補基于干涉測量的光學衍射層析成像方式的缺點和不足，推動三維折射率成像在生物醫藥領域中的應用，各種基于非干涉測量的層析成像技術在近幾年逐漸發展起來。由于采用基于非干涉的測量方式，相機上只有散射場的光強數據被記錄，而相位信息完全丟失，因此無論對于二維定量相位成像還是三維衍射層析成像，所有基于聚焦探測的非干涉測量成像方式都需要滿足匹配照明條件(照明數值孔徑等于物鏡數值孔徑)，才能實現相位或折射率信息的正確恢復。然而，在實際應用中很難嚴格實現匹配照明條件，特別是對于高數值孔徑顯微系統，若采用油浸物鏡，則必須借助聚光鏡才有可能實現照明條件的匹配。在不滿足匹配照明條件的情況下，由于捕獲的強度頻譜中低頻頻譜存在重疊，導致無法完整恢復相位分量，也就是說，不能正確恢復樣品的三維折射率。所以，如何規避匹配照明條件，即在任意照明下都能實現基于非干涉測量的衍射層析成像，精確重建待測樣品的三維折射率分布，并且能達到非相干衍射極限成像分辨率是一大技術難題。

發明內容