[發明專利]一種人iPSC來源的錐體神經細胞前體細胞及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202210541679.X
• 申請日: 2021-02-24
• 公開（公告）號: CN115192610A
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發明（設計）人: 陳志國;李默
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學宣武醫院
• 主分類號: A61K35/30
• 分類號: A61K35/30;A61P25/00;C12N5/0793;C12N5/074
• 代理公司: 北京市君合律師事務所 11517
• 代理人: 魏宇明;酒向飛

本發明提供了一種人iPSC來源的錐體神經細胞前體細胞及其制備方法和應用，屬于脊髓損傷治療技術領域，通過Dorsomorphin小分子化合物誘導人iPSC分化為錐體神經細胞前體細胞，分化比例高達90％以上，本發明提供的錐體神經細胞前體細胞，移植大鼠撞擊模型后，能夠顯著改善大鼠的運動功能。將所述錐體神經細胞前體細胞移植到免疫缺陷小鼠以及經免疫抑制劑注射后的大鼠，所述分化錐體神經細胞前體細胞能夠移植存活，并表現出較強的軸突投射能力。

本分案申請是中國專利申請號為202110207737.0、申請日為2021年2月24日、發明名稱為“一種人iPSC來源的錐體神經細胞前體細胞及其制備方法和應用”的中國專利申請案的分案申請。

技術領域

本發明屬于脊髓損傷治療技術領域，尤其涉及一種人iPSC來源的錐體神經細胞前體細胞及其制備方法和應用。

背景技術

脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)是一種嚴重的神經系統損傷疾病，是由于外部創傷造成了脊髓灰質和白質受損壞死，損傷區繼發炎癥反應，形成的血栓加重脊髓缺血，而膠質細胞大量增生形成的瘢痕組織阻礙神經纖維的再生，導致神經元和神經纖維的變形壞死。脊髓損傷能導致患者不同程度的截癱。脊髓損傷不僅會給患者本人帶來身體和心理的嚴重傷害，還會對整個社會造成巨大的經濟負擔。由于脊髓損傷所導致的社會經濟損失，針對脊髓損傷的預防、治療和康復已成為當今醫學界的一大課題。

到目前為止脊髓損傷仍是難以治愈的疾病之一，神經的修復再生較難，因此，如何有效保護神經細胞促進神經修復是恢復神經功能的決定性因素，目前較多用于此研究的細胞為干細胞，如胚胎干細胞(Embryonic stem cells，ESCs)、間充質干細胞(Marrowstromal cells，MSCs)、神經干細胞/神經前體細(Neural stem/progenitor cells，NSPCs)、嗅鞘細胞(Olfactory ensheathing cells，OECs)、施旺細胞(Schwann cells，SCs)和誘導多功能干細胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)等。

目前在研究的細胞對于脊髓損傷的治療主要作用在神經的營養支持及保護方面，主要體現在移植細胞可以分泌神經營養因子或支持作用以促進宿主神經細胞的再生，然而損傷軸突跨損傷部位的長距離穩健再生以及隨后的臨床改善仍然是一個具體的挑戰。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種人iPSC來源的錐體神經細胞前體細胞及其制備方法和應用；將所述錐體神經細胞前體細胞(PNPs)移植大鼠后，PNPs發育成錐體神經元，其軸突向宿主脊髓組織中延伸，延伸方向主要向尾側；移植細胞接受脊髓上神經元的突觸連接，且與宿主神經元在病灶尾部形成下游突觸連接，能夠重建神經元的連接回路，從而恢復脊髓損傷大鼠的運動功能。

為了實現上述發明目的，本發明提供了以下技術方案：

本發明提供了一種人iPSC來源的錐體神經細胞前體細胞的制備方法，包括以下步驟：

1)將人iPSC接種于matrigel基質膠上，并用iPSC細胞專用培養基中預培養2d；

2)將上述細胞培養液直接更換為第一誘導分化培養基，進行第一誘導分化培養獲得第一分化細胞；

3)將所述第一分化細胞置于第二誘導分化培養基中進行第二誘導分化培養獲得第二分化細胞；

4)將所述第二分化細胞分離下來，接種于鋪有PDL/Laminin的培養皿中，并置于第三誘導分化培養基中進行第三誘導分化培養獲得錐體神經細胞前體細胞；

所述第一誘導分化培養基為DDM培養基+終濃度0.2～2μmol/L的Dorsomorphin+20mL/L的B27；

所述第一誘導分化培養的時間為14～18d；