[發明專利]一種利用木糖及含木糖水解液發酵生產1，4-丁二胺的方法

有效

• 申請號: 202210540955.0
• 申請日: 2022-05-17
• 公開（公告）號: CN114774342B
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發明（設計）人: 徐美娟;饒志明;楊鳳玉;宋云海;楊套偉;張顯
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/77;C12N15/61;C12N15/60;C12N15/54;C12N15/55;C12N9/12;C12N9/78;C12N9/88;C12N9/90;C12P13/00;C12R1/15
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

本發明公開了一種利用木糖及含木糖水解液發酵生產1，4?丁二胺的方法，屬于基因工程技術領域。本發明通過采用大腸桿菌和鈍齒棒桿菌之間的穿梭質粒pEC?XK99E，將來源于Escherichia?coli?K?12的木糖異構酶和木酮糖激酶編碼基因簇在先前構建的1,4?丁二胺高產菌株PC0中表達。搖瓶發酵結果表明，原始菌PC0不具有代謝利用木糖的能力，而重組鈍齒棒桿菌具有此能力，可以直接利用木糖及含木糖水解液直接進行1,4?丁二胺的生產。最終在5?L發酵罐72h發酵可以積累33.4g·Lsupgt;?1/supgt;1,4?丁二胺。本發明方法生產1,4?丁二胺，具有效率高、副產物L?精氨酸、胍基丁胺和其他雜酸含量低的優點，后期對于產物1,4?丁二胺的分離純化更加容易。

技術領域

本發明涉及一種利用木糖及含木糖水解液發酵生產1，4-丁二胺的方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

1,4-丁二胺(也稱1,4-二氨基丁烷或腐胺)是一種含有兩個氨基的四碳化合物，是自然界中生物多胺的一種。1,4-丁二胺作為一種具有多種應用的化合物，在聚合物和藥物等農業領域、工業領域具有重要作用。

目前，工業發酵生產氨基酸及衍生物主要以葡萄糖為底物，但是為了減少與其他工業應用形成競爭，以更低值的生物質原料替代葡萄糖進行發酵是一種前景廣闊的生產方式。然而，在各種生物質水解液中除了富含葡萄糖外，還含有大量以木糖為主的五碳糖。因此，利用水解液發酵生產1,4-丁二胺的主要難題轉化為開發高效利用木糖的重組菌株。

雖然在現有報道中，木糖已被用于生產1,4-丁二胺，但是其具有最終產量低的缺點，例如：Volker?F.Wendisch等人研究公開的方法中，是通過過表達野油菜黃單胞菌來源的木糖異構酶和谷氨酸棒桿菌來源的木酮糖激酶構建木糖代謝途徑，但是最終生成的1,4-丁二胺的產量僅有15.1mM(公開于“Accelerated?pentose?utilization?byCorynebacterium?glutamicum?for?accelerated?production?of?lysine,glutamate,ornithine?and?putrescine”論文當中)。

因此，如何構建高效利用木糖的重組菌株，開發以生物質原料為底物進行發酵合成1,4-丁二胺的高效生產菌株成為研究的難點。

發明內容

本發明提供了一種重組鈍齒棒桿菌，所述重組鈍齒棒桿菌同時表達了木糖異構酶和木酮糖激酶。

所述重組鈍齒棒桿菌以鈍齒棒桿菌CGMCC?NO.0890為表達宿主，以質粒pEC-XK99E和pXMJ19為表達載體，過表達了精氨酸脫羧酶突變體、胍丁胺酶、木糖異構酶和木酮糖激酶；所述精氨酸脫羧酶突變體是通過將氨基酸序列如SEQ?ID?NO?1所示的精氨酸脫羧酶第533位的丙氨酸突變成脯氨酸得到的；其中，采用pXMJ19載體表達了精氨酸脫羧酶突變體和胍丁胺酶；采用pEC-XK99E載體表達了木糖異構酶和木酮糖激酶。

所述鈍齒棒桿菌(Corynebacterium?crenatum)CGMCC?NO.0890記載于公開號為CN1441055A的專利申請文本中，此菌株在專利申請文本中的菌株編號為SDNN403，發明人在本發明的實驗過程中將其重新編號為SYPA5-5。

在本發明的一種實施方式中，所述胍丁胺酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO?2所示，所述木糖異構酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO?3所示，所述木酮糖激酶的氨基酸序列如SEQ?IDNO?4所示。

在本發明的一種實施方式中，編碼所述胍丁胺酶的核苷酸序列如SEQ?ID?NO?5所示，編碼所述木糖異構酶的核苷酸序列如SEQ?ID?NO?6所示，編碼所述木酮糖激酶的核苷酸序列如SEQ?ID?NO?7所示。

在本發明的一種實施方式中，所述重組鈍齒棒桿菌還包括，采用組成型啟動子P52取代pEC-XK99E載體上的誘導型啟動子trc；所述組成型啟動子P52的核苷酸序列如SEQ?IDNO?8所示。