[發明專利]一種以葡萄糖為碳源合成2’-巖藻糖基乳糖的菌株及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202210532913.2
• 申請日: 2022-05-10
• 公開（公告）號: CN115011535A
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 夏洪志;徐錚;儲呈慧;李古月;牛堃;李江波;孫怡;楊陳亮;張建鴻;朱宇雷
• 申請（專利權）人: 南通勵成生物工程有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/54;C12N15/52;C12P19/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京和信華成知識產權代理事務所(普通合伙) 11390
• 代理人: 申龍華

1.一種以葡萄糖為碳源合成2’-巖藻糖基乳糖的菌株，其特征在于，將重組質粒pACYCDuet-J23115-LacY和ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT共轉化到大腸桿菌獲得；

所述重組質粒pACYCDuet-J23115-LacY是將質粒pACYCDuet-1與LacY基因連接，并將質粒pACYCDuet-1中的T7啟動子替換為J23115啟動子；

所述重組質粒ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT是將質粒ptrc99a與ManCB基因簇、Gmdfcl基因簇、FucT基因、質粒ptrc99a的trc啟動子、質粒ptrc99a的終止子連接后得到。

2.根據權利要求1所述的菌株，其特征在于，所述LacY基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

3.根據權利要求1所述的菌株，其特征在于，所述ManCB基因簇的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；

所述Gmdfcl基因簇的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述FucT基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述質粒ptrc99a的trc啟動子的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述質粒ptrc99a的終止子的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

所述J23115啟動子的核苷酸序列如SEQ ID No.45所示。

4.根據權利要求1所述的菌株，其特征在于，所述重組質粒pACYCDuet-J23115-LacY和ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT的質量比為1:1。

5.根據權利要求1所述的菌株，其特征在于，所述大腸桿菌包括大腸桿菌JM109(DE3)。

6.權利要求1-5任一項所述的菌株的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將質粒pACYCDuet-1經限制性內切酶NdeI和EcoRV雙酶切，得到線性質粒；

2)將所述步驟1)得到的線性質粒與LacY基因連接，得到重組質粒pACYCDuet-LacY，以所述重組質粒pACYCDuet-LacY為模板，經PCR擴增，得到不含有T7啟動子的基因序列；

3)將所述步驟2)不含有T7啟動子的基因序列與J23115啟動子經BsaI和T4DNA連接酶催化，得到重組質粒pACYCDuet-J23115-LacY；

4)將質粒ptrc99a與ManCB基因簇、Gmdfcl基因簇、FucT基因、質粒ptrc99a的trc啟動子、質粒ptrc99a的終止子經BsaI和T4DNA連接酶催化，得到重組質粒ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT；

5)將所述步驟3)得到的重組質粒pACYCDuet-J23115-LacY與步驟4)得到的重組質粒ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT共轉化到大腸桿菌中，得到菌株。

7.權利要求1-5任一項所述的菌株在以葡萄糖為碳源合成2’-巖藻糖基乳糖中的應用。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述應用包括：將所述菌株接種到發酵培養基中進行發酵，當發酵液的OD600為1時，加入終濃度為0.05-0.2mM IPTG和5g/L乳糖，繼續發酵，得到2’-巖藻糖基乳糖。

9.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述發酵培養基中葡萄糖的含量為15g/L。

10.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述發酵的條件包括：發酵的溫度為37℃，發酵的轉速為220rpm；

所述繼續發酵的條件包括：繼續發酵的溫度為25℃，繼續發酵的轉速為220rpm，繼續發酵的時間為60h。