[發明專利]一種β-葡萄糖苷酶突變體A354P及其應用

有效

• 申請號: 202210525603.8
• 申請日: 2022-05-06
• 公開（公告）號: CN115011582B
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發明（設計）人: 李玉;路福平;李慶剛;楊子璇;王茂軍;史超碩;劉逸寒
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/81;C12N15/70;C12N1/21;C12N1/19;C12P19/02;C12P7/22;C12R1/84;C12R1/19
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 郭曉迪

本發明主要利用定點突變技術構建來源于特異腐質霉的β?葡萄糖苷酶的突變體菌株，獲得了一種葡萄糖耐受能力提高的β?葡萄糖苷酶突變體A354P，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：4所示。相同條件下，突變體A354P的比活力為36.71U/mg，較野生型提高了40.28％；而且突變體A354P可在600mmol/L葡萄糖的激活下最高達到190.29％的相對活力，相比野生型具有顯著提高的葡萄糖耐受能力；突變體A354P對于虎杖苷也具有更強的水解能力。本發明中的突變體在生物燃料、食品保健和生物合成等領域具有較高的應用價值。

技術領域

本發明屬于微生物與基因工程技術領域，具體涉及一種酶活力和葡萄糖耐受性提高的β-葡萄糖苷酶突變體A354P及其應用。

背景技術

β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidases?EC?3.2.1.21)，全稱β-D-葡萄糖苷水解酶，屬水解酶類，又稱纖維二糖酶、龍膽二糖酶或苦杏仁苷酶。該酶可以水解結合于末端的非還原性的β-D-糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖以及相應的配基。β-?葡萄糖苷酶因對多種糖苷類化合物具有水解活性，可作用于多種生物活性物質，其水解產生的配基多為功能性苷元或芳香成分；有的β-葡萄糖苷酶還具有轉糖苷活性，可轉化生成功能性低聚糖，因此在食品保健，生物能源等領域具有廣闊的應用前景。

近年來能源問題日益嚴峻，新型能源的開發至關重要，生物能源由于其來源廣泛、可再生等優勢已成為研究者的關注重點，被認為是未來能源的首選，對其進行研究開發已成為全球發展趨勢。全球每年有約2千億噸的光合作用的有機物產生，其中約有60％以上是木質纖維素。并且我國作為農業生產大國，有十分豐富的木質纖維素資源可以被利用。而纖維素是自然界中來源最廣、含量最多的植物多糖。從結構上來說，其基本重復單元為纖維二糖，是?D-葡萄糖單體分子以β-1,4-糖苷鍵連接起來的線性多糖化合物。但是天然纖維素中，結晶區的纖維素結構緊致，不容易被分解，就使得天然纖維素水解較為困難。而酶解法降解纖維素，過程簡單，成本低，基本不會存在環境污染問題。研究表明，β-葡萄糖苷酶是整個纖維素水解過程中的限速酶，在酶解法降解纖維素過程中其關鍵作用，因此提高β-葡萄糖苷酶酶活在生物能源領域具有重要意義。

同時，具有高耐受性的β-葡萄糖苷酶因其可降低葡萄糖對酶活力的抑制作用，而顯示出獨特的應用潛能。CN102220302A以來自海洋未培養微生物來源的β-葡萄糖苷酶為基礎，通過PCR定點突變，獲得突變基因，相對野生型β-?葡萄糖苷酶蛋白，獲得的突變蛋白的葡萄糖耐受濃度提高了13倍。?CN103266096A通過將β-葡萄糖苷酶基因Pbgl的386位的色氨酸突變成半胱氨酸，得到β-葡萄糖苷酶突變體Pbgl-W386C，葡萄糖的耐受性是突變前的11.88?倍，提高了10.88倍。CN105754973A通過將鏈霉菌的β-葡萄糖苷酶S-bgl6分子上的233位色氨酸突變成天冬氨酸而得到β-葡萄糖苷酶突變體，和突變前相比，葡萄糖的耐受性提高了208.9倍。CN107142254A將來源于嗜酸耐熱脂環酸芽孢桿菌Alicyclobacillussp.A4的β-葡萄糖苷酶的315位氨基酸由組氨酸突變為精氨酸，得到較高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體，在相同條件下，葡萄糖對突變體和野生型的酶活促進作用分別為212％和163％。

發明內容

針對當前產業需求和現有技術的不足，本發明主要目的是通過定點突變技術構建一種酶活力和葡萄糖耐受性提高的β-葡萄糖苷酶突變體。

為了實現上述目的，本發明采取如下的技術方案：

第一方面，本發明提供一種β-葡萄糖苷酶突變體，所述β-葡萄糖苷酶突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：4所示。

第二方面，本發明提供編碼所述β-葡萄糖苷酶突變體的基因。

第三方面，本發明提供包含所述β-葡萄糖苷酶突變體的基因的載體。

第四方面，本發明提供包含如上所述基因或載體的重組菌株。