[發明專利]一種人外周血免疫細胞庫和干細胞庫的構建方法

在審

• 申請號: 202210518999.3
• 申請日: 2022-05-13
• 公開（公告）號: CN114807031A
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發明（設計）人: 陳莉;鄧長江;尚現崗;李春娜;夏冬梅;王范
• 申請（專利權）人: 山東賽恩福干細胞工程集團有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/0775;A01N1/02;C40B50/06
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 韓百翠

本發明公開了一種人外周血免疫細胞庫和干細胞庫的構建方法。該方法包括：一次采集人外周血，采用密度梯度離心法結合差速離心法獲得外周血單個核細胞；一部分細胞直接凍存，另一部分細胞，通過流式細胞儀分選出CD3⁺淋巴細胞，進行CIK細胞擴增培養，編碼凍存；分選出CD3⁺淋巴細胞后的剩余細胞，通過流式細胞儀分選出CD56⁺淋巴細胞，進行NK細胞擴增培養，編碼凍存；分選出CD56⁺淋巴細胞后的剩余細胞，通過流式細胞儀分選出CD34^?細胞進行MSC細胞培養，再編碼凍存。該方法一次采集外周血，分離單個核細胞，可以同時分離NK細胞、CIK細胞和MSC細胞，滿足多種需求，避免了多次采血的問題。

技術領域

本發明涉及一種人外周血免疫細胞庫和干細胞庫的構建方法，屬于細胞培養和細胞庫構建領域。

背景技術

細胞治療是指獲取人自體或異體來源的具有特定功能的活細胞，經體外分離、純化、培養、擴增、凍存、復蘇、質檢合格后，回輸入人體，起到治療疾病和抗衰老的作用。根據細胞類型，細胞治療可分為干細胞治療、免疫細胞治療和體細胞治療等。

從1960年，老鼠骨髓中的不斷增殖及可分化的造血干細胞的發現，人們漸漸認識到干細胞的存在，到英國科學家在1997年克隆出多利羊，意識到干細胞的再生作用，再到山中伸彌利用體細胞成功誘導出多能干細胞(iPSC)，50年的時間內，干細胞技術發展迅速，人們開始希望能夠通過干細胞來治療各類重大疾病以及再生各種組織器官。隨著2012年諾貝爾醫學獎頒給誘導多能干細胞(iPSC)，干細胞的潛在醫學應用在世界各國得到了更為廣泛的重視，而隨著中國老齡化進程的加快，利用存儲的干細胞進行個體化治療的前景也越來越接近現實。干細胞治療是再生醫學革命最先進的臨床治療技術，該技術是指通過對干細胞進行分離、體外培養、定向誘導、甚至基因修飾等過程，在體外繁育出全新的、正常的甚至更年輕的細胞、組織或器官，并最終通過細胞組織或器官的移植實現對臨床疾病的治療。免疫治療就是指基于免疫學的原理與方法，采集人體外周血或臍血等來源的免疫細胞，進行體外大規模培養擴增，以增強靶向性殺傷功能，再回輸入人體內，通過調動人體免疫系統殺傷血液與組織中的病原體、癌細胞及突變細胞，抑制腫瘤生長，增強機體免疫力?，F在臨床應用較多的免疫細胞包括CIK細胞、NK細胞、NKT細胞等。

細胞凍存是細胞長期保存最有效的方法之一。每個人都有屬于自己獨特的細胞，如果在年輕健康時，將優質的細胞提前凍存在-196℃的深低溫液氮罐中，就可以讓細胞停止老化，永久保持在最年輕、最有活力的狀態。將來一旦身體需要，就可利用提前儲備的種子細胞培養出更多優質的細胞，用于提高機體免疫力，改善/增強身體狀況、抵抗癌癥，甚至挽救生命。為了方便儲存各種細胞資源，目前全世界范圍內已經建立多家細胞庫或生物樣本庫，包括臍帶血庫，臍帶間充質干細胞庫，免疫細胞庫等。

外周血是免疫細胞和干細胞的重要來源之一，在一定的誘導條件下可以擴增培養NK(natural killer cell，自然殺傷細胞)、CIK(cytokine-induced killer，細胞因子誘導的殺傷細胞)和iPSC(induced pluripotent stem cells，誘導性多能干細胞)等細胞。收集100mL人體外周血，一般可分離得到0.6-1.5×10⁸的單個核細胞，目前通過文獻和專利檢索，發現多數方法也是直接將外周血單個核細胞凍存，待使用時復蘇單個核細胞再進行培養，這種方法培養的CIK細胞、NK細胞等擴增效率低，細胞殺傷活力較差，無法滿足臨床需要。而且，凍存的外周血單個核細胞復蘇后得率大概只有50％，數量只夠一種細胞比如擴增培養CIK細胞使用，很多時候還需要面臨二次采血、三次采血的問題。因此，急需要一種新的方法，一次采血，就可以實現不同種類細胞包括干細胞和免疫細胞的凍存需求，不需要多次采血，同時分別凍存干細胞和免疫細胞，以后可針對不同疾病的治療，干細胞可用于慢性疾病包括糖尿病、肝病、心腦血管疾病、神經系統疾病的治療，免疫細胞可用于腫瘤治療、提升免疫力、亞健康調理等。

發明內容