[發(fā)明專利]一種外泌體分泌誘導(dǎo)劑、誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210507949.5
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN114836375B
• 公開（公告）日: 2023-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張建民;王靚;曲典;林埕宇
• 申請（專利權(quán)）人: 國典（北京）醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N5/074;A61K35/28;A61P39/06
• 代理公司: 北京尚誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11322
• 代理人: 葉占洋;魯兵

本發(fā)明公開了一種外泌體分泌誘導(dǎo)劑、誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的外泌體分泌誘導(dǎo)培養(yǎng)基僅可包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和四種添加物：L?抗壞血酸或其鹽、硒或其鹽、NaHCOsubgt;3/subgt;和Insulin，其成分簡單，但可以顯著提高干細(xì)胞分泌的外泌體的產(chǎn)量，從而可以顯著降低外泌體的生產(chǎn)成本；生產(chǎn)獲得的外泌體可以更有效保護神經(jīng)元免受損傷和改善衰老細(xì)胞情況。

本申請為申請日2020年12月31日、申請?zhí)?02011636845.1、發(fā)明名稱“一種外泌體分泌誘導(dǎo)劑及誘導(dǎo)培養(yǎng)基和應(yīng)用其的外泌體的生產(chǎn)方法及應(yīng)用”的分案申請。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種外泌體分泌誘導(dǎo)劑及誘導(dǎo)培養(yǎng)基和應(yīng)用其的外泌體的生產(chǎn)方法及應(yīng)用，尤其涉及外泌體在制備改善衰老細(xì)胞情況和/或保護神經(jīng)元的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

外泌體是包含了復(fù)雜RNA和蛋白質(zhì)的特異性分泌的小膜泡(30～150nm)，其參與細(xì)胞間通訊，調(diào)節(jié)多種組織器官的正常功能和損傷修復(fù)。

由于來源于不同的組織的外泌體具有其特異性蛋白分子和其行使功能的關(guān)鍵分子，因此來源于干細(xì)胞的外泌體具備干細(xì)胞的重要治療作用且更加安全，可以有效轉(zhuǎn)運具有疾病治療作用的RNA和蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)，具有抑制細(xì)胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)、促進血管生成、抑制纖維化、提高組織修復(fù)潛力等重要生物學(xué)功能。另外，外泌體還能夠穿透血腦屏障，并且能夠遞送小分子藥物等各種治療分子，具有非常廣闊的臨床應(yīng)用前景，因此從干細(xì)胞中高效生產(chǎn)獲得這一類外泌體尤為重要。現(xiàn)有外泌體獲取方式主要是細(xì)胞自分泌，然而其產(chǎn)量非常有限。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題的一個或多個，本發(fā)明的一個方面提供一種外泌體分泌誘導(dǎo)劑，其包含以下使用濃度的成分：

本發(fā)明另一方面提供一種外泌體分泌誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和以下濃度的成分：

且所述外泌體分泌誘導(dǎo)培養(yǎng)基不包含Transferrin、FGF2和TGFβ1/NODAL的組合。

上述外泌體分泌誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和以下濃度的成分：

上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12。

本發(fā)明另一方面還提供一種生產(chǎn)外泌體的方法，其包括以下步驟：

1)將對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)至覆蓋率達到60％～70％；

2)換用上述的外泌體分泌誘導(dǎo)培養(yǎng)基對步驟1)貼壁培養(yǎng)的干細(xì)胞進行外泌體分泌誘導(dǎo)培養(yǎng)20～30小時，取上清收獲含外泌體的細(xì)胞培養(yǎng)液；

3)從步驟2)收獲的含外泌體的細(xì)胞培養(yǎng)液中分離獲得外泌體；

優(yōu)選地，重復(fù)步驟2)2～3次，合并每次收獲的含外泌體的細(xì)胞培養(yǎng)液，從所述合并的細(xì)胞培養(yǎng)液中分離獲得外泌體。

上述方法中，步驟1)中所述干細(xì)胞選自胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。

上述方法中，步驟3)中所述分離的方法包括差速離心法、超濾離心法、密度梯度離心法、沉淀法、磁珠免疫法、PS親和法、色譜法。

上述方法生產(chǎn)的外泌體或含外泌體的細(xì)胞培養(yǎng)液也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)，所述外泌體的數(shù)量達到外泌體在干細(xì)胞中的分泌量≥1000個/細(xì)胞，所述外泌體的粒徑為30～150nm(主要為50～80nm)，表面標(biāo)志物中CD9占比≥23％，CD63占比≥10％。