[發(fā)明專利]基于閉合雙極電極的雙色電致變色傳感器及其應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2022-05-10
• 公開（公告）號: CN115112638A
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉芳;王昕霞;孫芝蘭;王道營;徐為民;諸永志
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;G01N21/78;G01N27/327;G01N33/543;G01N33/569
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237
• 代理人: 肖明芳

本發(fā)明提出了一種基于閉合雙極電極的雙色電致變色傳感器，其組成包括連接有銅綠假單胞菌特異性適配體的磁珠、ITO雙極電極、電致發(fā)光溶液和普魯士藍沉積液。將上述雙色電致變色傳感器應(yīng)用于快速檢檢測銅綠假單胞菌，利用閉合雙極電極陰極和陽極的物理分隔優(yōu)勢，避免了PB與Ru(bpy)₃²⁺之間的相互干擾，從而極大地提高了本傳感器的準確性和靈敏度，并實現(xiàn)了可視化檢測和多色電致變色檢測，本傳感器能夠在0~10⁸ CFU mL^?1內(nèi)靈敏檢測銅綠假單胞菌，檢測限低至1 CFU mL^?1，同時能夠有效避免出現(xiàn)假陽性結(jié)果。本發(fā)明將磁分離技術(shù)、雙極電極、電致發(fā)光和電致變色結(jié)合方法為銅綠假單胞菌的可視化檢測提供了一條準確、快速的途徑，在食品檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物傳感器領(lǐng)域，具體涉及一種基于閉合雙極電極的雙色電致變色傳感器及其在快速檢檢測銅綠假單胞菌上的應(yīng)用。

背景技術(shù)

銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)是一種分布廣泛的條件致病性革蘭氏陰性菌，其適應(yīng)性強，耐抗生素，可以在人、動物和環(huán)境中循環(huán)傳播，嚴重影響著人類健康，因此研究一種快速檢測銅綠假單胞菌的方法具有重要意義。平板菌落計數(shù)法是通用的檢測細菌的“金標準”，但是其耗時較長，平均需要4-5天才能獲得檢測結(jié)果。其他細菌檢測方法如聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、生物傳感器、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)等，雖然具有較高等的靈敏度和特異性，但是需要專業(yè)的操作人員、復(fù)雜的操作或者昂貴精密的儀器，這極大地限制了細菌快速檢測的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于閉合雙極電極的雙色電致變色傳感器，用于實現(xiàn)銅綠假單胞菌的快速可視化檢測。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種基于閉合雙極電極的雙色電致變色傳感器，包括連接有銅綠假單胞菌特異性適配體(PA aptamer)的磁珠(MBs)、ITO雙極電極(BPE)、電致發(fā)光溶液和普魯士藍沉積液。ITO雙極電極(BPE)為閉合雙極電極，閉合雙極電極可以將電化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為光信號，易于讀出的同時降低了數(shù)據(jù)的處理難度；此外，陰極和陽極之間的反應(yīng)是互不干擾的。

所述連接有銅綠假單胞菌特異性適配體的磁珠的制備方法如下：活化磁珠，將銅綠假單胞菌特異性適配體加入活化后的磁珠中，在20-25℃、200-300r/min下孵育，優(yōu)選地，孵育時間為1-2h。棄上清，洗滌，然后加入BSA和緩沖液封閉未連接銅綠假單胞菌適配體的羧基，得到連接有銅綠假單胞菌特異性適配體的磁珠。其中，所述活化后的磁珠為羧基化磁珠。

優(yōu)選地，所述銅綠假單胞菌的特異性適配體(PA aptamer)的核苷酸序列為：5’-TTT TTC CCC CGT TGC TTT CGC TTT TCC TTT CGC TTT TGT TCG TTT CGT CCC TGC TTCCTT TCT TG-3’，可購買于生工生物工程(上海)股份有限公司；磁珠優(yōu)選為羧基磁珠，可購買于生工生物工程(上海)股份有限公司，粒徑范圍在0.3μm左右，貨號為D110541-0500。磁珠活化液選用活化液25mM NHS和25mM EDC。

在一個具體的實施方式中，通過如下方法制備：首先，活化磁珠(MBs)，吸取10 μLMBs至2mLEP管中，用90μL PBS洗滌2～3次后，加入100μL活化液(25mM NHS和25mM EDC)，25℃300r/min，孵育1～2h；然后，用移液槍吸掉活化液，PBS 洗滌2～3次，添加1μL銅綠假單胞菌適配體(PA aptamer)，89μL PBS，25℃300r/min，孵育1h；最后，棄上清，PBS洗滌2～3次，加入10μL BSA和90μL PBS封閉未連接PA aptamer的羧基。BSA終濃度為2μg mL^-1。每一個步驟完成后需用90μL PBS清洗磁珠2～3次。