[發(fā)明專利]一種阿尼芬凈前體棘白菌素B高產(chǎn)菌株及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210496768.7
• 申請日: 2022-05-09
• 公開（公告）號: CN114907989B
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 呂雪峰;劉永娟;黃雪年;王貝貝;周宇;谷猛
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P21/04;C07K7/56;C12R1/66
• 代理公司: 北京秉文同創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11859
• 代理人: 張文武;陳少麗

本發(fā)明公開了一種產(chǎn)棘白菌素B菌株高效誘變和快速篩選的方法。首先通過常壓室溫等離子體(ARTP)誘變，然后通過抑菌圈法篩選初篩、搖瓶發(fā)酵復(fù)篩和發(fā)酵優(yōu)化試驗后，獲得了一株高產(chǎn)、穩(wěn)定性強的菌株ARTP?7，該菌株棘白菌素B產(chǎn)量達(dá)到1.8g/L，比誘變前提高了240％。將ARTP誘變和抑菌圈初篩結(jié)合使用，顯著提高了菌株的篩選效率，結(jié)合發(fā)酵優(yōu)化，實現(xiàn)了棘白菌素B突變菌株的快速篩選。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物育種技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及ARTP誘變技術(shù)，是一種高產(chǎn)棘白菌素B菌株的誘變選育方法，尤其涉及通過上述方法篩選到的一種阿尼芬凈前體棘白菌素B高產(chǎn)菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

棘白菌素類藥物是一種新型抗真菌藥物，通過抑制β-1,3-葡聚糖合成酶活性來干擾真菌細(xì)胞壁的合成，哺乳動物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，因此該類藥物的毒副作用小，且安全性高，對念珠菌屬、曲霉菌屬及部分對唑類耐藥的真菌類均有抗菌活性。現(xiàn)已獲得批準(zhǔn)上市的棘白菌素類藥物包括卡泊芬凈(2004年在美國上市)、米卡芬凈(2005年在日本上市)和阿尼芬凈(2006年在美國上市)，它們都具有相似的非核糖體六元環(huán)肽類母核結(jié)構(gòu)，差異僅在于側(cè)鏈基團、氨基酸連接順序和后修飾基團的不同。其中卡泊芬凈和米卡芬凈已在國內(nèi)上市，阿尼芬凈由于產(chǎn)量低，市場售價高，臨床中的應(yīng)用推廣受到了一定的影響，具有廣闊的市場前景。

阿尼芬凈的工業(yè)生產(chǎn)包括三個過程，首先是由Aspergillus?nidulans發(fā)酵合成前體化合物棘白菌素B，然后再經(jīng)過猶他游動放線菌發(fā)酵水解掉脂肪鏈，最后通過化學(xué)方法加上一個人工合成的側(cè)鏈獲得阿尼芬凈。其中，Aspergillus?nidulans發(fā)酵合成阿尼芬凈前體棘白菌素B是工業(yè)生產(chǎn)的第一步，也是整個工藝的關(guān)鍵核心。高性能的發(fā)酵菌株是控制生產(chǎn)成本的關(guān)鍵因素，也是限制該行業(yè)準(zhǔn)入的技術(shù)門檻。目前，國內(nèi)外學(xué)者提升棘白菌素B發(fā)酵水平的研究主要著眼于誘變育種、發(fā)酵優(yōu)化與調(diào)控和代謝工程。但是，進一步的系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)核心途徑可供理性改造的靶點有限，相較于理性改造，誘變育種的隨機性特點在菌株綜合發(fā)酵性能改良時更能發(fā)揮出優(yōu)勢，尤其是對于相對復(fù)雜的多細(xì)胞微生物，所以目前工業(yè)生產(chǎn)使用的絕大多數(shù)放線菌和絲狀真菌菌株都是通過誘變育種獲得的。有效微生物育種方法的缺乏使棘白菌素B產(chǎn)量的進一步大幅度提高受到限制，為了適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)要求，需要通過合適的遺傳育種手段快速提高棘白菌素B生產(chǎn)菌株的發(fā)酵水平。本發(fā)明通過ARTP誘變、抑菌圈法初篩、搖瓶發(fā)酵復(fù)篩和發(fā)酵優(yōu)化后，獲得了一株高產(chǎn)、穩(wěn)定性強的菌株。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一株高產(chǎn)棘白菌素B的菌株，所述菌株為構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)ARTP-7,所述菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC?No.40073，保藏日期為2022年1月29日，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，電話：[phone]。

在一個實施方式中，本發(fā)明所述菌株的誘變條件輸出功率100W，照射距離1mm，氣體流速10L·min^-1，樣品量10μL，通入氣體為氦氣，處理時間60s-540s，最佳誘變時間180s。

另一方面，本發(fā)明還提供了一種菌劑，所述菌劑包括上述菌株。

在一個實施方式中，所述菌劑為液體制劑或固體制劑。

另一方面，本發(fā)明還提供了一種微生物培養(yǎng)方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：將上述菌株使用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并收集含有上述菌株的培養(yǎng)物。

另一方面，本發(fā)明還提供了上述菌株或菌劑在生產(chǎn)棘白菌素B中的應(yīng)用。

另一方面，本發(fā)明還提供了一種制備棘白菌素B的方法，所述方法包括對上述菌株進行發(fā)酵的步驟。

在一個實施方式中，上述發(fā)酵的溫度為20℃-40℃，優(yōu)選，25℃；上述發(fā)酵的時間為2d-20d，例如，10d-15d。