[發明專利]一種聚合酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 202210495569.4
• 申請日: 2022-05-09
• 公開（公告）號: CN114574465B
• 公開（公告）日: 2022-08-05
• 發明（設計）人: 胡學軍;曹利勤
• 申請（專利權）人: 上海眾啟生物科技有限公司;上海先賽生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12
• 代理公司: 上海雙誠知識產權代理事務所(普通合伙) 31423
• 代理人: 高利丹

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種ZO5 DNA聚合酶突變體及其應用。具體技術方案為：一種ZO5 DNA聚合酶突變體，在ZO5野生型聚合酶基礎上突變獲得，所述ZO5野生型聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；突變位點包括：E628K、I709L、E744R、A745R。本發明提供的聚合酶突變體可以擴大其包括逆轉錄酶在內的多種活性的能力，可以使用RNA模板催化逆轉錄環介導的等溫擴增。融合結合肽后的聚合酶突變體，具有很強的抗干擾能力，例如巧克力、花生醬、牛奶、海鮮、肉或蛋，巧克力、胡椒、血液、尿液、腐植酸、膽汁、單寧、黑色素、靛藍染料、植物材料等的干擾；并可有效縮短LAMP所需時間。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種聚合酶突變體及其應用。

背景技術

Taq聚合酶和Bst聚合酶是兩種眾所周知的耐熱DNA聚合酶，兩者的晶體結構有50%的序列同源性。Taq聚合酶可以催化PCR（該反應要求酶必須耐受94℃），但Bst聚合酶的活性為65～70℃，因此不能催化PCR。同時，Taq聚合酶不能通過置換其前面的DNA鏈來復制雙鏈DNA，且Taq聚合酶的5'-核酸內切酶會降解置換的DNA；但Bst聚合酶可以有效地進行鏈置換而不降解，因此通常用于催化環介導的等溫擴增（LAMP）。但Taq聚合酶和Bst聚合酶都沒有逆轉錄酶（RT）活性,因此通常需要將單獨的RT酶與之結合以完成RT-PCR（逆轉錄酶聚合酶鏈反應）或類似的RT-LAMP。

與之相對的，ZO5 DNA聚合酶具有很強的逆轉錄酶聚合酶鏈反應（RT-PCR）活性,但不能通過鏈置換使DNA鏈復制雙鏈DNA,因此不能用于催化環介導的等溫擴增（LAMP）或者RT-LAMP。

為了通過PCR或者類似的LAMP擴增RNA目標，有必要先將RNA模板逆轉錄成cDNA。在RT-PCR或者類似的RT-LAMP中，混合酶由于各自的反應最佳條件不同而很難發揮各自的優勢。通常，RT-PCR測定依賴于源自嗜常溫生物體、用于初始cDNA合成步驟（RT）的非熱穩定的逆轉錄酶（RNA依賴性DNA聚合酶）。在PCR中，需要額外的熱穩定DNA聚合酶用于擴增cDNA，以耐受對于核酸變性所需的溫度升高。

發明內容

本發明的目的是提供一種DNA聚合酶突變體及其應用。

為實現上述發明目的，本發明所采用的技術方案是：一種ZO5 DNA聚合酶突變體，在ZO5野生型聚合酶基礎上突變獲得，所述ZO5野生型聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；突變位點包括：E628K、I709L、E744R、A745R。

優選的，突變位點還包括：E710K、E710L、E710N、E710Q、E710I、E710W、E710R、E710V、E710S中任意一項的突變。

優選的，所述聚合酶突變體對所述野生型聚合酶進行截短后獲得。

優選的，在所述野生型聚合酶的第282位進行截短。

優選的，所述聚合酶突變體中融合了結合肽。

優選的，所述結合肽選擇Sso 7d、Tm Csp、Sac 7d中的任意一種。

相應的，一種聚合酶突變體，所述聚合酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

相應的，一種聚合酶突變體，所述聚合酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

相應的，所述聚合酶突變體在PCR、RT-PCR、LAMP、RT-LMAP中的應用。

相應的，包含所述聚合酶突變體的試劑、試紙、試劑盒。

本發明具有以下有益效果：使用工程改造的熱活性或熱穩定DNA聚合酶以進行更有效的逆轉錄用于RT-PCR或者類似的RT-LAMP測定具有幾個潛在的益處：