[發明專利]酶分子機器技術制備無支鏈的直鏈半乳聚糖的方法及應用

在審

• 申請號: 202210482092.6
• 申請日: 2022-05-05
• 公開（公告）號: CN115161361A
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發明（設計）人: 黃代勇;黃云琦;盧曉會;劉志格;徐曙光
• 申請（專利權）人: 武漢東方天琪生物工程有限公司
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;C12P19/14;A23L33/21;A61P1/00;A61P25/28;A61P37/02
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1.酶分子機器技術制備無支鏈不同分子段直鏈半乳聚糖的方法，其特征在于：

⑴第1次酶解

用超聲波聲化技術輔助酶解技術——采用市售食品級α-D-普魯藍酶和β-D半乳糖苷酶協同作用，以降解脫除阿拉伯糖半乳聚糖(AG)上的半乳糖+阿拉伯糖之復合物支鏈：

①為提高酶解效率，參照現有技術，采用超聲波的空化作用以輔助后續的酶解過程：

②將含半乳聚糖主鏈的阿拉伯糖半乳聚糖原料按底物濃度 6～8%調漿混勻，用氨水調節pH至8.0～8.5，用超聲波裝置于25 MHz、強度30%的超聲波處理30min；

③將超聲處理過的產物置于真空離心機，設定溫度30℃，1400rpm，離心去除少量的游離氨，調節pH至7.0～7.5，干燥后置室溫放置2 h；

④將α-D-普魯藍酶和β-D半乳糖苷酶按2：1的比例配成復合酶A，在協同作用下初步酶解脫除阿拉伯糖+半乳聚糖支鏈：

⑤在500L酶解罐中，加水350L，底物濃度 6～8%，添加復合酶A 2～5.0%；

⑥酶解罐溫度保持在 50～55℃，攪拌40～60r/min，pH 6.5～7.5，酶解時間：2～3小時，在酶解過程中采用分光光度法快速測定酶解液中還原糖含量(以推知脫支程度)，當還原糖含量達到20.0 %時(本發明的該工序指標是≥20 %)，即可停止酶解脫支；

⑦將上述酶解液離心去渣后用薄板換熱器升溫至130℃，3～5s瞬間滅酶，絮凝去蛋白，硅藻土過濾機過濾去雜與澄清；

⑧離子交換裝置脫鹽，為下工序納濾的污染防治創造條件；

⑨澄清酶解液再經1kDa超濾或600Da納濾分離出半乳糖+阿拉伯糖之復合物，半乳糖+阿拉伯糖之復合物得率為20%，而已初步脫支的直鏈半乳聚糖稱為“1＃產物”；

⑵第2次酶法水解——用超聲波聲化技術輔助酶解技術——用α-L-阿拉伯糖苷酶、β-D-木糖苷酶和β-D半乳糖苷酶按1：0.5：0.5的比例配成復合酶B，作用于前述“1＃產物”，繼續脫除AG支鏈；

①為提高酶解效率，參照現有技術，采用超聲波的空化作用以輔助后續的酶解過程：

②將“1＃產物”按底物濃度 6～8%調漿混勻，用氨水調節pH至8.0～8.5，用超聲波裝置于25 MHz、強度30%的超聲波處理30min；

③將超聲處理過的產物置于真空離心機，設定溫度30℃，1400rpm，離心去除少量的游離氨，調節pH至7.0～7.5，干燥后置室溫放置2 h；

④在500L酶解罐中，按有效容量70%計，加入上述超聲處理過的產物350kg， 50～55℃，攪拌40～60 r/min，pH 在 7.0～7.5之間，按0.5～0.8%添加 復合酶B酶法水解，繼續脫除前述“1＃產物”中剩余的的阿拉伯糖+半乳糖支鏈；

⑤酶解1.5小時后，用分光光度法快速測定酶解液中還原糖含量，當還原糖含量達到18.0 %(本發明的該工序指標是≥18.0%)時，即可停止酶解脫支；

⑥對上述酶解液進行滅酶與過濾澄清，再經1kDa超濾或600Da納濾分離出阿拉伯糖+半乳糖之復合物，該復合物得率為18%，經第2次脫支后，其產物為基本無支鏈的直鏈半乳聚糖，稱為“2＃產物”，以上2次酶法水解共獲得阿拉伯糖+半乳糖支鏈為38%，脫支率為89%；直鏈半乳聚糖的得率為25.0%；

⑶第3次酶法水解——用β-半乳聚糖酶對上述“2＃產物”——已基本脫支鏈的直鏈半乳聚糖進行適度并可控的酶法水解：

①在500L酶解罐中，按有效容量70%計，加入已脫除阿拉伯糖+半乳糖支鏈的直鏈半乳聚糖350kg，調整pH 在 6.5～7.5之間，加熱至 2＃產物”之比為 1: 10～15加酶，并攪拌均勻，酶解1.5～2小時，在酶解過程中用NDJ-型旋轉粘度計，以 12rpm 的轉速檢測 50℃ 時酶解液的粘度，當酶解液粘度為250～300 mPa?s時，停止降解；

③離心分離與去雜，用薄板換熱器升溫至130℃，3～5s瞬間滅酶、過濾澄清；

④再次離子交換脫鹽，可稱為“3＃產物”——即“已基本脫除阿拉伯糖+半乳糖支鏈的不同分子段直鏈半乳聚糖的混合糖液”，占阿拉伯糖半乳聚糖原料的得率為25%，伴生的阿拉伯糖+半乳糖之復合物為38.0%，換算成脫支率為89.0%。