[發明專利]一種破骨前體細胞膜仿生納米顆粒及制備方法和應用

在審

• 申請號: 202210471438.2
• 申請日: 2022-04-28
• 公開（公告）號: CN115029310A
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發明（設計）人: 王清清;王皓立;劉欣;林賢豐
• 申請（專利權）人: 浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078;C12N5/0786;A61K48/00;A61P19/10;B82Y5/00;B82Y30/00
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙) 33240
• 代理人: 楊舟濤

1.一種破骨前體細胞膜仿生納米顆粒，其特征在于：包括可靶向破骨前體細胞的破骨前體細胞膜和包覆于破骨前體細胞膜中的可電荷反轉的基因轉染材料；所述的可電荷反轉基因轉染材料由可電荷反轉的陽離子聚合物與核酸藥物通過靜電自組裝形成的納米復合物；該破骨前體細胞膜仿生納米顆粒在細胞微環境下實現電荷反轉從而釋放核酸藥物。

2.根據權利要求1所述的一種破骨前體細胞膜仿生納米顆粒的制備方法，其特征在于：所述的可電荷反轉的基因轉染材料粒徑為30～200nm。

3.根據權利要求1所述的一種破骨前體細胞膜仿生納米顆粒的制備方法，其特征在于：所述的核酸藥物為siRNA、microRNA或DNA中的至少一種。

4.根據權利要求1所述的一種破骨前體細胞膜仿生納米顆粒的制備方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟：

(1)基因轉染材料的制備

將B-PDEAEA白色固體溶于10mM的HEPES緩沖溶液，HEPES緩沖溶液的pH為7.4，37℃孵育10分鐘，將核酸藥物配置成40μg/mL的溶液，將B-PDEAEA用10mM的HEPES緩沖溶液稀釋成250～1500μg/mL，HEPES緩沖溶液的pH為7.4，按體積比1:1加入到40μg/mL的核酸藥物溶液中，渦旋振蕩10～30s，室溫靜置20～30分鐘,得到氮磷摩爾比為5～30的納米復合物溶液；

(2)提取破骨前體細胞膜

提取哺乳動物單核細胞，15～30ng/mL M-CSF誘導3～5天得到巨噬細胞，再用30～80ng/mL RANKL誘導3～5天，獲得破骨前體細胞；洗滌，胰酶消化后，用4℃的TM緩沖液重懸，所述TM緩沖液為1mM MgCl₂和10mM Tris加水混合，并將PH調至7.4；重懸后利用微型注射器擠出30～40次以破壞細胞；

加入1M蔗糖與細胞勻漿混合，達到0.25M蔗糖終濃度；將得到的混合物4℃、2000xg條件下離心10分鐘，收集上清液，4℃、3000xg條件下離心30～35分鐘，用0.25M蔗糖溶液重懸沉淀洗滌，再次4℃、3000xg條件下離心30～35分鐘，得到沉淀即為細胞膜，用10mM HEPES緩沖溶液重懸至1～2mg/mL，HEPES緩沖溶液的pH為7.4；

(3)破骨前體細胞膜仿生納米顆粒的制備

將步驟(2)得到的破骨前體細胞膜與步驟(1)得到的可電荷反轉的基因轉染材料體積比0.5～2混合，優選為0.5～1.5；對混合物超聲混合1～3分鐘，最后將混合物反復擠壓通過聚碳酸酯多孔膜。

5.根據權利要求3所述的一種破骨前體細胞膜仿生納米顆粒的制備方法，其特征在于：所述的氮磷摩爾比為10。

6.根據權利要求3所述的一種破骨前體細胞膜仿生納米顆粒的制備方法，其特征在于：所述的哺乳動物單核細胞為6～8周C57BL/6J小鼠脛骨及股骨單核細胞。

7.根據權利要求3所述的一種破骨前體細胞膜仿生納米顆粒的制備方法，其特征在于：所述的胰酶消化為胰酶消化3～5min后，終止消化并1000rpm，5min離心。

8.根據權利要求3所述的一種破骨前體細胞膜仿生納米顆粒的制備方法，其特征在于：所述的微型注射器為1ml胰島素注射器。

9.根據權利要求3所述的一種破骨前體細胞膜仿生納米顆粒的制備方法，其特征在于：所述的反復擠壓次數為5～20次。

10.根據權利要求3所述的一種破骨前體細胞膜仿生納米顆粒的制備方法，其特征在于：所述的聚碳酸酯的孔徑為100～400nm。

11.一種破骨前體細胞膜仿生納米顆粒，其特征在于：所述的破骨前體細胞膜仿生納米顆粒作為轉染材料載體或制備靶向藥物的應用。