[發明專利]一種白首烏花中抗氧化和抗炎活性成分的分離制備及篩選方法

有效

• 申請號: 202210466315.X
• 申請日: 2022-04-29
• 公開（公告）號: CN114773187B
• 公開（公告）日: 2023-05-12
• 發明（設計）人: 武毅;王路;周輝;王雙;田陌童;武晨陽;丁曉雪;吳昱;周洪雷;戴琛;萬鑫
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C07C59/90
• 分類號: C07C59/90;C07C59/42;C07C51/42;C07C51/47;C07D311/30;C07D311/40;C07H17/07;C07H1/08;G01N30/72;G01N30/02
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 宋海海

1.一種白首烏花中抗氧化和抗炎活性成分的分離制備及篩選方法，其特征在于，所述方法包括：

S1、白首烏花粉碎后加入溶劑浸泡提取，回收溶劑，濃縮、干燥得浸膏；

S2、將浸膏加水混懸，依次使用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，得不同部位的萃取物；

S3、測定各部位萃取物中的抗氧化和抗炎作用，篩選活性最好的乙酸乙酯部位；

S4、采用UPLC-MS法測定乙酸乙酯活性部位的主要化合物結構；

S5、對乙酸乙酯部位的化合物成分進行分離，包括初次分離采用硅膠柱色譜，后續分離采用凝膠柱色譜、聚酰胺柱色譜或制備型HPLC；

所述步驟S5中，對乙酸乙酯部位的化合物成分進行分離，包括以下步驟：乙酸乙酯部位與甲醇按照1:1溶解，g/mL，與硅膠按照1:1，g/g，拌樣，上硅膠柱，二氯甲烷-甲醇系統梯度洗脫，薄層層析法檢測各流份，合并相同流份，回收溶劑，得到Fr.1～Fr.8；Fr.4與甲醇按照1:1溶解，g/mL，與硅膠按照1:1，g/g，拌樣，上硅膠柱，二氯甲烷-甲醇系統梯度洗脫，薄層層析法檢測各流份，合并相同流份，得流份Fr.4-1～Fr.4-6；Fr.4-5上凝膠柱，二氯甲烷-甲醇系統洗脫，薄層層析法檢測各流份，合并相同流份，回收溶劑，得到流份Fr.4-5-1～Fr.4-5-12；Fr.4-5-3～Fr.4-5-6及Fr.4-5-7～Fr.4-5-10分別合并，上制備型HPLC，甲醇-水系統和乙腈-水系統反復分離，得到化合物1、2和化合物3、4；Fr.6與甲醇按照1:1溶解，g/mL，上聚酰胺柱，甲醇-水系統梯度洗脫，薄層層析法檢測各流份，合并相同流份，得到流份Fr.6-1～Fr.6-12；Fr.6-2～Fr.6-4與Fr.6-6～Fr.6-9分別合并，上制備型HPLC，甲醇-水系統和乙腈-水系統反復分離，得到化合物5和化合物6～11；

共獲得11種活性化合物，為2-反式-4-反式-脫落酸1、(2E,4E)-8-羥基-2,7-二甲基-癸二烯-(1,10)-二酸2、槲皮素3、山奈酚4、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷5、蘆丁6、槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷7、異槲皮苷8、槲皮素-3-O-β-D-木糖苷9、槲皮素-3-O-α-L-鼠李吡喃糖苷10、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷11。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S1中，

所述溶劑為含水1-90％，體積分數的低級醇，或者為含水1-90％的丙酮、或水飽和乙酸乙酯、水飽和二氯甲烷、水飽和正丁醇；

浸泡提取溫度是常壓狀態下室溫或加熱條件；

濃縮條件為減壓狀態下加熱沸騰；

干燥為冷凍干燥或減壓干燥；

所述低級醇為甲醇或乙醇；所述浸泡提取溫度為常壓狀態下0℃～30℃，所述加熱溫度為30℃至溶劑沸騰；所述濃縮條件減壓壓強為-0.1～-0.09MPa，所述加熱溫度為20℃至溶劑沸騰。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述冷凍干燥條件為溫度-80℃～-20℃；壓強-0.1～-0.09MPa；干燥時間為5～7天；所述減壓干燥條件為減壓狀態下0℃～30℃或至加熱沸騰。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述至加熱沸騰溫度不超過45℃。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S2中，

萃取次數為每種萃取溶劑5～7次，所述萃取溫度為0℃～30℃。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S3中，測定各部位萃取物中的抗氧化和抗炎作用的具體方法包括采用DPPH法和ABTS法對白首烏花不同萃取部位浸膏的抗氧化活性進行測定；以及采用RAW246.7細胞為靶細胞，通過測定各萃取部位對靶細胞釋放細胞因子和NO的影響，篩選具有抗炎作用的活性萃取部位。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，測定RAW246.7釋放細胞因子的含量采用ELISA法；

測定RAW246.7釋放NO含量的含量采用Griess法。