[發(fā)明專利]一種多重?zé)晒鈖cr檢測(cè)EGFR基因突變的引物和探針組合物、試劑盒和檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210464909.7
• 申請(qǐng)日: 2022-04-29
• 公開（公告）號(hào): CN114592045A
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高如霞;孫克京;洪兵;邢紅兵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇吉諾思美精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6858
• 分類號(hào): C12Q1/6858;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 南京中律知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32341
• 代理人: 沈振濤

1.一種多重?zé)晒鈖cr檢測(cè)EGFR基因突變的引物和探針組合物，其特征在于，所述組合物包括19del、S768I、L858R、EGFR 20ins、T790M、L861Q、G719X及內(nèi)控的引物和探針，上述引物和探針分為組1、組2和組3，如下表所示：

。

2.一種多重?zé)晒鈖cr檢測(cè)EGFR突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求1所述的引物和探針組合物。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多重?zé)晒鈖cr檢測(cè)EGFR突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含：

NEB universal probe qPCR master mix、權(quán)利要求1所述的引物和探針組合物、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多重?zé)晒鈖cr檢測(cè)EGFR突變的試劑盒，其特征在于，所述陽(yáng)性對(duì)照包括質(zhì)粒DNA和野生型DNA混合物；所述陰性對(duì)照包括無(wú)核酸酶水。

5.權(quán)利要求1所述的引物和探針組合物，或權(quán)利要求2所述的試劑盒在基于多重?zé)晒鈖cr檢測(cè)EGFR突變中的應(yīng)用。

6.一種多重?zé)晒鈖cr檢測(cè)EGFR突變的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)準(zhǔn)備樣品；

(2)構(gòu)建多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增反應(yīng)體系，包括分別由權(quán)利要求1所述的組1、組2和組3構(gòu)成的三種反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR反應(yīng)；

(3)根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增儀顯示的△ct值判定檢測(cè)結(jié)果。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多重?zé)晒鈖cr檢測(cè)EGFR突變的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述樣品包括組織樣本，F(xiàn)FPE樣本或胸腹水樣本。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多重?zé)晒鈖cr檢測(cè)EGFR突變的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述三種反應(yīng)體系包括：

19delL858R體系：權(quán)利要求1所述的組1、NEB universalprobeqPCR mastermix、樣本；

L858REGFR 20ins體系：權(quán)利要求1所述的組2、NEB universalprobeqPCR mastermix、樣本；

T790ML861QG719體系：權(quán)利要求1所述的組3、NEB universalprobeqPCR mastermix、樣本。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多重?zé)晒鈖cr檢測(cè)EGFR突變的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述PCR反應(yīng)的條件如下：

第一階段：95℃，1min，1個(gè)循環(huán)；

第二階段：95℃，15s，64℃，30s，10個(gè)循環(huán)；

第三階段：95℃，15s，60℃，30s，38個(gè)循環(huán)；

信號(hào)收集：第三階段60℃時(shí)收集FAM/VIC/ROX/CY5信號(hào)，執(zhí)行實(shí)時(shí)PCR，保存文件。

10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多重?zé)晒鈖cr檢測(cè)EGFR突變的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述根據(jù)△ct值判定檢測(cè)結(jié)果的方法如下：

突變由FAM/ROX/CY5信號(hào)指示，內(nèi)控由VIC信號(hào)指示，通過計(jì)算△ct值的大小進(jìn)行判斷，反應(yīng)管的△ct值≤cutoff值時(shí)，則樣本為該反應(yīng)管對(duì)應(yīng)信號(hào)突變陽(yáng)性，反之則為陰性或低于試劑盒的檢測(cè)下線；△ct值＝ct值突變位點(diǎn)-ct值內(nèi)控。