[發明專利]鑒定人類胚胎骨髓來源的間充質干細胞的方法、探針和試劑盒及其用途

在審

• 申請號: 202210460405.8
• 申請日: 2022-04-28
• 公開（公告）號: CN114752688A
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發明（設計）人: 周永勝;張萍;喬杰;湯富酬;董驥
• 申請（專利權）人: 北京大學口腔醫學院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;A61K35/28;A61P19/08
• 代理公司: 中國貿促會專利商標事務所有限公司 11038
• 代理人: 張小勇

本發明涉及鑒定和篩選人類胚胎骨髓來源的間充質干細胞的方法、相關檢測劑組合和試劑盒以及相關應用。本發明以單細胞分辨率對人類胚胎BM有核細胞(BMNC)進行了全面篩查，使用兩種互補策略(STRT和10X基因組學)進行scRNA?seq分析，鑒定出LIFR⁺PDGFRB⁺是MSC的特異性標志物。本發明還發現LIFR⁺PDGFRB⁺CD45^?CD31^?CD235a^?MSC可以在體內有效地重建造血微環境。本發明還鑒定了表達TM4SF1⁺CD44⁺CD73⁺CD45^?CD31^?CD235a^?的單能骨祖細胞亞群，其具有成骨潛力。因此，本發明鑒定了兩種類型的人類胚胎骨髓MSC，本發明將加深對人類胚胎骨髓來源的MSC的認識以及進一步促進對MSC臨床應用的理解。

技術領域

本發明涉及生物領域，并具體涉及一種在單細胞分辨率上通過單細胞轉錄組學和功能分析從分子和功能上鑒定人類胚胎骨髓來源的間充質干細胞的方法。

背景技術

長期以來，骨髓(bone marrow，BM)來源的間充質干細胞(mesenchymal stromal/stem cell，MSC)一直被描述為可以自我更新并產生基質、骨、軟骨和脂肪的細胞類群^1-5。然而，過去對MSC的認識主要集中于體外研究，其在體內的真實身份至今尚未完全明確。使用基因編輯小鼠的幾項研究表明，小鼠BM中的LepR⁺、Nestin⁺和Grem1⁺基質細胞，除了具有MSC活性外，還是造血干細胞HSC微環境的重要組分，具有支持HSC的功能^6-8。盡管在過去幾十年中通過轉基因小鼠已經擴展了我們對MSC的認識，但由于材料限制，目前對人類BM中不同MSC亞群的了解仍然有限⁹。

最近，Huelsken的研究小組發現，小鼠BM原代MSC移植后可在體內重建骨髓基質功能，而這些細胞在體外培養2周后再進行移植，則不再具備重建骨髓基質的功能¹⁰。另有研究表明，體外培養會顯著減少MSC在骨髓和脾臟的歸巢¹¹。據報道，CD146可標記人骨髓MSC，然而，當把CD146⁺細胞在體外進行培養時，CD146表達水平則會發生顯著變化^13，14。此外，原代MSC在體外擴增后，細胞的DNA甲基化也會發生顯著差異¹⁵。所有這些研究都清楚地表明，MSC的體外特征并不能真實地反映其體內功能。然而，目前對人類骨髓MSC的了解主要是通過體外培養系統來實現的。因此，鑒定人類骨髓MSC體內真實身份的策略將對以MSC為基礎的臨床轉化應用提供很大的幫助。

單細胞RNA測序(single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq)技術的最新突破使得研究人員能夠以單細胞分辨率研究新鮮分離的原代細胞，并研究人類MSC在體內的真實身份¹⁶。另一方面，基于每個細胞的轉錄組，研究人員可以更好地了解不同MSC類群的復雜性和異質性¹⁷。

發明內容

在本研究中，本發明人以單細胞分辨率對人類胚胎BM有核細胞(BMNC)進行了全面篩查(圖1a)。本發明人對來源于46個發育周為6周到24周的人類胚胎的原代BMNC，使用兩種互補策略(STRT和10X基因組學)進行scRNA-seq分析，以平衡數據準確性。基于系統的生物信息學分析和實驗驗證，本發明人鑒定了兩種類型的人類胚胎骨髓來源的MSC。本發明將加深對人類胚胎骨髓來源的MSC的認識以及進一步促進對MSC臨床應用的理解。