[發明專利]一種抗羊口瘡和綿羊痘的重組DNA疫苗及其重組質粒

在審

• 申請號: 202210448759.0
• 申請日: 2022-04-26
• 公開（公告）號: CN114807225A
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發明（設計）人: 陸慧君;文美玲;趙魁;王妍;高飛;賀文琦;關繼羽;李姿
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A61K39/275;A61P31/20
• 代理公司: 天津市尚文知識產權代理有限公司 12222
• 代理人: 黃靜

本發明提供了一種重組DNA疫苗及其重組質粒，DNA疫苗重組質粒包括抗原編碼序列和質粒載體，所述抗原編碼序列包括串聯的羊口瘡抗原編碼序列和綿羊痘抗原編碼序列，所述羊口瘡抗原和綿羊痘抗原表達為獨立的抗原蛋白。本發明提供了一種羊口瘡病毒基因和綿羊痘病毒基因的雙基因重組DNA疫苗的構建，以及小鼠免疫效果分析。本發明選擇羊口瘡病毒B2L(011)基因與綿羊痘病毒P32基因，用自剪切肽P2A將兩個基因串聯，自剪切肽P2A在真核細胞內發生自剪切，使兩個抗原蛋白在真核表達載體pcDNA3.1(+)上獨立表達。本發明所制備的重組DNA疫苗在免疫小鼠后也產生了較好的免疫效果，可作為候選疫苗的參考。

技術領域

本發明屬于動物基因工程技術領域，具體涉及一種羊口瘡病毒基因和綿羊痘病毒基因的雙基因重組DNA疫苗的制備方法和免疫小鼠后的效果評價。

背景技術

羊口瘡病毒(又名羊傳染性膿皰病毒，Orf virus，ORFV)屬于副痘病毒屬，雙股DNA病毒，是一種具有嗜上皮性的人畜共患病病毒，主要感染山羊和綿羊，給養羊業造成巨大的經濟損失；其病變局限于皮膚黏膜和口腔，會形成紅斑或結痂，病毒粒子可存在于結痂內，并隨著結痂脫落而掉落到環境中，再次感染宿主。該病毒具有耐干燥的特性，因此羊群中一旦感染會反復發作，難以根除。

綿羊痘病毒(Sheep pox virus，SPPV)是羊痘病毒屬中有囊膜的雙股DNA病毒，是一種急性接觸性傳染病病毒。主要感染綿羊，發病率可達100％，成年羊致死率達50％，而羔羊的致死率可高達100％，綿羊痘病阻礙了珍貴品種的引進和養羊業的規模化發展。該病好發于無被毛區域，如口腔、鼻腔、乳房、尾巴腹側等，會由最初的紅斑發展成丘疹，嚴重時可蔓延全身，形成隆起的球狀結節。

羊口瘡和綿羊痘二者臨床癥狀具有一定的相似性，因鑒別診斷錯誤而影響防控會對養羊業造成不可估量的經濟損失。目前市面上仍舊沒有一種可以推廣的治療藥物或疫苗，因此，研制一種能同時預防這兩種疫病，又易于生產、運輸和保存的二聯疫苗具有很大的意義。

DNA疫苗屬于基因工程疫苗，當攜帶抗原基因的DNA載體進入細胞、誘導抗原表達后，抗原被主要組織相容性復合體(MHC)呈遞后被T細胞識別，從而激發宿主的免疫應答；DNA疫苗具有易于制造、穩定性好、無需冷鏈和引起宿主適當的免疫反應等諸多優點，易于推廣。

抗原蛋白的選擇對DNA疫苗效果起關鍵作用，本發明選擇了羊口瘡的B2L(011)基因和綿羊痘的P32基因。羊口瘡病毒的B2L基因大小為1137bp。已有實驗證明，將B2L基因與流感基因疫苗共同接種小鼠，可以顯著提高對小鼠的保護力，佐證了羊口瘡的B2L蛋白是一種可以提高免疫原性的蛋白。綿羊痘P32基因大小為972bp，可編碼P32蛋白，該蛋白早已應用于ELISA法來檢測羊和牛血清中的羊痘抗體，P32基因也是診斷試劑和疫苗的熱門靶點。以上研究都表明，羊口瘡病毒的B2L基因與綿羊痘病毒的P32基因表達的蛋白產物具有良好免疫原性。

發明內容

本發明公開一種羊口瘡病毒基因和綿羊痘病毒基因的雙基因重組DNA疫苗的構建，以及小鼠免疫效果分析。本發明選擇羊口瘡病毒B2L基因與綿羊痘病毒P32基因，根據相關文獻報道，其對應編碼的B2L蛋白與P32蛋白均具有良好的免疫原性，因此使用自剪切肽P2A的DNA片段將兩個基因串聯，克隆至真核表達載體，轉染真核細胞后進行Western Blot分析，結果表明，翻譯后的多肽在P2A處發生了自剪切，使B2L及P32兩種蛋白在真核細胞內獨立表達。本發明所制備的重組質粒在免疫小鼠后也產生了較好的免疫效果，可作為候選疫苗的參考。

本發明提供了一種重組DNA疫苗，包括抗原編碼序列和質粒載體，所述抗原編碼序列包括串聯的羊口瘡抗原編碼序列和綿羊痘抗原編碼序列，所述羊口瘡抗原和綿羊痘抗原表達為獨立的抗原蛋白。

優選的是，所述抗原編碼序列包括自剪切多肽編碼序列，表達過程中，所述羊口瘡抗原編碼序列和綿羊痘抗原編碼序列表達的抗原蛋白通過自剪切多肽分開。