[發明專利]一種生物合成原兒茶酸甲酯的菌株及應用

在審

• 申請號: 202210444745.1
• 申請日: 2022-04-26
• 公開（公告）號: CN114606174A
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發明（設計）人: 華夏;丁葉;李亞
• 申請（專利權）人: 南京合谷生命生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/11;C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 南京聚匠知識產權代理有限公司 32339
• 代理人: 沈菊

1.一種生物合成原兒茶酸甲酯的菌株，其特征在于，該生物合成原兒茶酸甲酯的菌株是KPHS基因片段與線性化表達質粒載體連接環化的質粒pHG10轉化導入大腸桿菌感受態細胞篩選而成；

所述KPHS基因片段是含有KPHS基因的質粒經擴增獲得；

所述線性化表達質粒載體是表達質粒經反向擴增、消化獲得。

2.根據權利要求1所述的一種生物合成原兒茶酸甲酯的菌株，其特征在于，所述表達質粒為pet20b、pET28a或pThioHisA的一種；pet20b的核苷酸序列為SEQ ID No.5所示，pET28a的核苷酸序列為SEQ ID No.6所示，pThioHisA的核苷酸序列為SEQ ID No.7所示。

3.根據權利要求1所述的一種生物合成原兒茶酸甲酯的菌株，其特征在于，所述KPHS基因的核苷酸序列為SEQ ID No.1~SEQ ID No.14所示的任一序列。

4.根據權利要求1所述的一種生物合成原兒茶酸甲酯的菌株，其特征在于，所述大腸桿菌感受態細胞為大腸桿菌BL21、大腸桿菌BW25113、大腸桿菌W3110或大腸桿菌MG1655的一種。

5.根據權利要求1至權利要求4任一所述的生物合成原兒茶酸甲酯的菌株，其特征在于，所述生物合成原兒茶酸甲酯的菌株的構建方法，包括以下步驟：S1、環形質粒pHG10構建

S1.1、KPHS基因片段：以含有KPHS基因的質粒為模板，通過引物KPHS-F/KPHS-R進行PCR擴增，獲得KPHS基因片段；

S1.2、線性化表達質粒載體：以表達質粒為模板，通過引物質粒-F/質粒-R進行反向擴增，得到PCR產物，經過純化、I消化，獲得線性化表達質粒載體；

S1.3、環形質粒pHG10：將上述的KPHS基因片段和上述的線性化表達質粒載體進行連接環化，獲得環形質粒pHG10；

S2、重組菌株sHG10構建

S2.1、復蘇培養：將0.2~5μl質粒pHG10以化學轉化法導入50μl大腸桿菌感受態細胞中，冰浴30min后于42℃水浴中熱激60s進行熱休克處理，再進行冰浴2min，接著再加入1mL的LB液體培養基，在37℃下培養1h，獲得復蘇細胞液；

S2.2、平板培養：將復蘇細胞液涂布在LB瓊脂糖平板上，在37℃下過夜培養，長出菌落，通過菌落PCR篩選陽性克隆，獲得重組菌株sHG10，即生物合成原兒茶酸甲酯的菌株；

LB液體培養基的配方：每升培養基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，其余純水；LB瓊脂糖平板的配方：每升培養基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂10g，其余純水。

6.根據權利要求5所述的一種生物合成原兒茶酸甲酯的菌株，其特征在于，所述引物KPHS-F/KPHS-R中：KPHS-F的核苷酸序列為SEQ ID No.8所示，KPHS-R的核苷酸序列為SEQID No.9所示。

7.根據權利要求5所述的一種生物合成原兒茶酸甲酯的菌株，其特征在于，表達質粒為pet20b時，質粒-F/質粒-R為pet20b-F/pet20b-R，則pet20b-F的核苷酸序列為SEQ IDNo.10所示，pet20b-R的核苷酸序列為SEQ ID No.11所示；

表達質粒為pET28a時，質粒-F/質粒-R為pET28a-F/pET28a-R，則pET28a-F的核苷酸序列為SEQ ID No.12所示，pET28a-R的核苷酸序列為SEQ ID No.13所示；

表達質粒為pThioHisA時，質粒-F/質粒-R為pThioHisA-F/pThioHisA-R，則pThioHisA-F的核苷酸序列為SEQ ID No.14所示，pThioHisA-R的核苷酸序列為SEQ ID No.15所示。