[發明專利]一種基于磁分離和金酶免疫復合物檢測TeA含量的方法

在審

• 申請號: 202210444676.4
• 申請日: 2022-04-26
• 公開（公告）號: CN114609381A
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發明（設計）人: 孫鳳霞;彭夏雨;劉丹;劉銀銀;張建;李燦;崔雙雙;贠紫光
• 申請（專利權）人: 石河子大學
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535;G01N33/543
• 代理公司: 重慶博凱知識產權代理有限公司 50212
• 代理人: 張先蕓

本發明公開一種基于磁分離和金酶免疫復合物檢測TeA含量的方法，基于金納米表面同時負載辣根過氧化物酶（HRP）和抗TeA抗體構建金粒子?抗體/HRP納米復合物，即金酶免疫復合物；將TeA包被原（半抗原?OVA）通過EDC/NHS方法固定于羧基化納米磁珠表面，構建功能化磁納米粒子探針并包被于酶標孔內，其上的半抗原?OVA與樣品中的TeA直接競爭結合金酶免疫復合物表面的抗TeA抗體；利用底物顯色反應檢測吸光值變化來定量分析樣品中TeA含量。綜合利用納米磁珠快速分離富集目標物的優點、金納米粒子大比表面積增加HRP負載量以及金納米粒子的類酶活性對底物的雙重催化增敏效應，建立了磁珠分離和金酶免疫復合物信號增敏檢測方法，用于TeA含量的快速檢測。

技術領域

本發明涉及農產品安全免疫檢測技術領域，具體涉及一種基于磁分離和金酶免疫復合物檢測TeA含量的方法。

背景技術

真菌毒素污染是影響農產品質量安全的關鍵風險因子，真菌毒素是由真菌的有毒次級代謝產物，在農產品的生產、采收、貯藏與運輸等過程中均可自然發生，對人體具有強毒性，可致DNA損傷，即便在極低濃度下也可對人體健康造成危害，具有致畸、致癌、致突變等作用。細交鏈格孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）是一種由鏈格孢菌產生的毒性最強、檢出率最高的一種真菌毒素，已在番茄、葡萄、枸杞、柑桔、蘋果等產品中普遍檢出，給人體健康帶來極大安全隱患。因此，在持續加大監管力度和完善監管體系的同時，加強農產品中TeA高靈敏檢測技術研究十分必要。

目前TeA的檢測多采用儀器分析法，包括氣相色譜法、液相色譜法、液相色譜-質譜法等，這些技術在保障農產品安全中起到重要的作用，但存在一些問題，如需要昂貴的儀器設備和專業技術人員，對檢材要求較高，樣品前處理和提純過程費時費力，只能在實驗室進行檢測，不能滿足現代檢測對方便、快速的要求。

酶聯免疫吸附法（ELISA）操作簡便，對樣本要求不高，非常適合于企業自檢和各級基層檢測單位使用，是21世紀最有競爭力的分析方法，但是常規的ELISA方法通常需要抗原孵育，識別，洗滌等多步繁瑣的步驟，檢測時間較長，且需要昂貴的酶標二抗，整套方法較為費時、成本較高；同時，TeA的污染水平一般為μg/kg，對檢測方法的靈敏度提出更到要求，而常規ELISA檢測方法靈敏度較低，難以滿足痕量TeA高靈敏、快速檢測要求。

CN201611226282.2公開一種快速檢測細交鏈格孢菌酮酸的方法，基于辣根過氧化物酶催化魯米諾-過氧化氫發光體系，建立細交鏈格孢菌酮酸間接競爭化學發光酶聯免疫檢測方法，兼具化學發光法高靈敏度與免疫分析法特異性強的特點。但是，該方法所建立的化學發光法所需檢測時間長，約15h左右，檢測時間較長；同時需要用到酶標二抗、化學發光液等，所用試劑多，步驟繁瑣，還需要特殊儀器化學發光免疫分析儀，基層檢測單位常常不具備該儀器，實際應用中受到限制。

發明內容

針對現有技術存在的上述不足，本發明的目的在于提供一種基于磁分離和金酶免疫復合物檢測TeA含量的方法，解決現有細交鏈格孢菌酮酸檢測步驟繁瑣、檢測時間長、靈敏度和準確度較低，成本高的問題。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是這樣的：

一種基于磁分離和金酶免疫復合物檢測TeA含量的方法，基于金納米表面同時負載辣根過氧化物酶（HRP）和抗TeA抗體構建金粒子-抗體/HRP納米復合物，即金酶免疫復合物；將TeA包被原（半抗原-OVA）通過EDC/NHS方法固定于羧基化納米磁珠表面，構建功能化磁納米粒子探針并包被于酶標孔內，其上的半抗原-OVA與樣品中的TeA直接競爭結合金酶免疫復合物表面的抗TeA抗體；利用底物顯色反應檢測吸光值變化來定量分析樣品中TeA含量。

進一步，具體包括以下步驟：

S1、制備磁納米粒子探針：用半抗原-OVA修飾的磁納米粒子復合物，采用羧基化磁納米粒子，通過EDC/NHS法活化磁納米粒子表面的羧基后，加入半抗原-OVA溶液，磁分離純化得到包被原功能化磁納米粒子；