[發(fā)明專利]一種裂解酶pEf51和穿孔素蛋白pEf191的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210436629.5
• 申請日: 2022-04-25
• 公開（公告）號: CN114807106B
• 公開（公告）日: 2023-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 向盈盈;宋飛;季秀玲;涂渝嬌;王粟萍;蔣蕾;袁琳;黃浩
• 申請（專利權(quán)）人: 昆明市延安醫(yī)院
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/33;C12N15/70;C07K14/005;A61K38/51;A61K38/16;A61P31/04;A61P1/02
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

本發(fā)明公開了一種糞腸球菌噬菌體PEf771的裂解酶pEf51和穿孔素蛋白pEf191、其基因克隆純化方法及其應(yīng)用，所述糞腸球菌噬菌體裂解酶pEf51和穿孔素蛋白pEf191克隆自糞腸球菌噬菌體PEf771，裂解酶pEf51氨基酸總數(shù)202個，分子大小21.9kDa，蛋白分子式為C₉₇₂H₁₄₉₂N₂₆₀O₃₁₃S₁，等電點4.42；包含12個正電荷殘基，25個負電荷殘基；不穩(wěn)定指數(shù)為26.84，脂肪系數(shù)85.99，總的平均親水性為(GRAVY)?0.347，為可溶性蛋白；所述穿孔素pEf191基酸總數(shù)107個，相對分子質(zhì)量12.1kDa，蛋白分子式為C₅₅₀H₈₅₈N₁₄₂O₁₅₅S₆，等電點為8.96；不穩(wěn)定指數(shù)35.1所以該蛋白穩(wěn)定；脂肪系數(shù)為82.90，平均親水性(GRAVY)?0.115，為可溶性蛋白；并展開抑菌活性、裂解譜及糞腸球菌生物膜去除研究；通過SD大鼠腹腔感染模型，為進一步研究抗菌的應(yīng)用范圍奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種糞腸球菌噬菌體裂解酶和穿孔素蛋白的基因克隆純化方法及其應(yīng)用，具體涉及一種糞腸球菌噬菌體PEf771的中的裂解酶pEf51和穿孔素蛋白pEf191的應(yīng)用。

背景技術(shù)

糞腸球菌（ Enterococcus?faecalis）又叫做糞鏈球菌，一種兼性厭氧菌，有圓形、橢圓形兩種形態(tài)，直徑0.5～1.0?μm，菌落形態(tài)呈光滑的圓形，顏色灰白，大多數(shù)呈短鏈狀或者成對排列，無鞭毛、無芽孢，一般不運動，是自然界中存在比較廣泛的一種細菌，也是人類、其他哺乳動物和昆蟲胃腸道的共生菌群。作為正常菌群時，對人體或動物往往是有益菌，因為許多糞腸球菌可以產(chǎn)生細菌素或抗生素者等抑菌的成分，能抑制部分有害菌生長；此外，糞腸球菌還能以益生菌成分添加至動物飼料中。但根據(jù)世界衛(wèi)生組織對益生菌的篩選原則和嚴格定義，只有極少數(shù)糞腸球菌屬于益生菌，其他大部分均是無用或致病菌。當其出現(xiàn)在水體和土壤等環(huán)境時，屬于條件致病菌。近年來已逐漸成為人體中感染僅次于葡萄球菌的第二大革蘭氏陽性病原菌，當?shù)挚沽^低或者發(fā)生異位寄生時，均可能引起嚴重的細菌性感染。糞腸球菌具有很強的適應(yīng)和生存能力，并且是醫(yī)院相關(guān)感染中最常分離的物種之一，會引起心內(nèi)膜炎、菌血癥、尿路感染、口腔疾病以及其他致命形式的局部甚至全身感染，嚴重影響人類生命健康。

糞腸球菌與生物被膜密切相關(guān)的毒力因子包括脂磷酸壁、聚合物質(zhì)、性信息素、細胞溶血素和溶解酶，生物被膜的組成成分主要有EPS（胞外多糖）、胞外蛋白和eDNA（胞外DNA），其形成與表面蛋白（Esp）表達增多相關(guān)，它的發(fā)展主要分為三個階段：吸附、成熟、拆卸。形成生物被膜的第一階段為吸附，細菌能否附著取決于接觸面間形成的排斥力小于吸附力、接觸面積是否夠大，因此該階段可逆。Esp編碼的是糞腸球菌細胞壁上一個表面蛋白，其相對分子質(zhì)量較大，具有介導(dǎo)細菌間粘附的功能，因此在糞腸球菌生物被膜研究受到廣泛關(guān)注。據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院估計，至少65%的人類感染與生物被膜相關(guān)，進一步說明這種生長模式的重要性。群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorumsensing，QS)是細菌間的一種通信系統(tǒng)，通過分泌和響應(yīng)化學信號而相互交流，目前研究認為糞腸球菌生物被膜的形成由QS調(diào)控，使某些特定基因進行協(xié)同表達。糞腸球菌QS中Fsr組分的群體感應(yīng)依賴性調(diào)節(jié)系統(tǒng)可通過調(diào)控腸球菌表面蛋白（Esp）、明膠酶（GelE）、EbpC、SprE等表達來調(diào)節(jié)生物膜形成與成熟。據(jù)報道，許多腸球菌包括糞腸球菌均具有生物被膜形成能力，食品加工廠中腸球菌生物被膜會污染肉制品表層，這一發(fā)現(xiàn)有助于解釋為何腸球菌是在肉制品中產(chǎn)生的常見菌種，由于對胞外多糖基質(zhì)的保護，生物膜包裹的細菌細胞難以消除。