[發(fā)明專利]一種酵母細(xì)胞同源重組酶系、DNA體外組裝試劑及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210436102.2
• 申請(qǐng)日: 2022-04-25
• 公開（公告）號(hào): CN114717207B
• 公開（公告）日: 2023-03-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柳偉強(qiáng);楊平;付煜燁;許映沖;張斌;徐杰;齊金才
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州泓迅生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/00
• 分類號(hào): C12N9/00;C12N9/16;C12N9/14;C07K14/395;C12N15/55;C12N15/31;C12N9/12;C12P19/34;C12N15/12;C12N15/13;C12N15/50
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 薛紅凡

1.一種酵母細(xì)胞同源重組酶系，其特征在于，包括酵母核酸外切酶ExoI、酵母重組酶RAD51、酵母重組酶RAD52和酵母單鏈DNA結(jié)合蛋白R(shí)PA；

所述酵母核酸外切酶ExoI、酵母重組酶RAD51、酵母重組酶RAD52、酵母單鏈DNA結(jié)合蛋白R(shí)PA是經(jīng)過原核表達(dá)系統(tǒng)密碼子優(yōu)化獲得；

優(yōu)化后的酵母核酸外切酶ExoI的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

優(yōu)化后的酵母重組酶RAD51的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

優(yōu)化后的酵母重組酶RAD52的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

優(yōu)化后的酵母單鏈DNA結(jié)合蛋白R(shí)PA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述同源重組酶系，其特征在于，所述同源重組酶系還包括大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA連接酶和ATP再生酶；

所述ATP再生酶包括以下一種或幾種激酶：肌酸激酶、丙酮酸激酶、乙酸激酶、聚磷酸激酶和核苷二磷酸激酶。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述同源重組酶系，其特征在于，所述酵母核酸外切酶ExoI、酵母重組酶RAD51、酵母重組酶RAD52、酵母單鏈DNA結(jié)合蛋白R(shí)PA、大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA連接酶和ATP再生酶的活性比為（0.001~0.1）：（10~100）：（10~100）：（10~100）：（0.1~1）：（0.1~1）：（1~100）。

4.一種DNA體外組裝試劑，其特征在于，包括權(quán)利要求1~3任意一項(xiàng)所述同源重組酶系和2.6×緩沖液；

所述2.6×緩沖液為包含1~50mM鎂離子源、5~50mM堿金屬離子源、質(zhì)量百分含量2%~10%聚乙二醇、1~10mM NAD、2-20mM二硫蘇糖醇、1~10mM ATP再生酶底物、1~10mM脫氧核苷三磷酸的10~200mM Tris base緩沖液，pH值為7.0~8.0。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述DNA體外組裝試劑，其特征在于，所述DNA體外組裝試劑中酵母核酸外切酶ExoI的濃度為1~10 U/ml，酵母重組酶RAD51的濃度為10~100nM，酵母重組酶RAD52的濃度為10~100nM，酵母單鏈DNA結(jié)合蛋白R(shí)PA的濃度為100~500nM，大腸桿菌DNA聚合酶I的濃度為10~100U/ml，大腸桿菌DNA連接酶的濃度為1000~5000U/ml，ATP再生酶的濃度為1~10mM。

6.權(quán)利要求1~3任意一項(xiàng)所述同源重組酶系或權(quán)利要求4或5所述DNA體外組裝試劑在DNA片段體外組裝中的應(yīng)用。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括兩條及兩條以上DNA片段組裝；

所述DNA片段包括單鏈或雙鏈的DNA片段；

所述DNA片段體外組裝包括以下一種或幾種應(yīng)用：動(dòng)物來源靶基因的組裝、病毒來源靶基因或基因組的組裝和抗體庫DNA片段的組裝。

8.一種DNA片段體外組裝的方法，其特征在于，包括以下步驟：

將待組裝的DNA片段、線性載體與權(quán)利要求4或5所述DNA體外組裝試劑混合反應(yīng)，得到直鏈或環(huán)狀的DNA長片段；

所述待組裝的DNA片段含有長度為10~200bp的堿基同源或互補(bǔ)區(qū)域。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所述混合反應(yīng)后，將反應(yīng)產(chǎn)物導(dǎo)入原核細(xì)胞中完成DNA片段的擴(kuò)增，得到雙鏈DNA分子。