[發(fā)明專利]一種用于鑒定凡納濱對蝦特定抗病品系的EST-SSR標記及其擴增引物和應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210432073.2
• 申請日: 2022-04-22
• 公開（公告）號: CN114891895A
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王艷紅;陳廷;羅鵬;胡超群;任春華;江曉;張鑫
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 陳潔娣;劉明星

本發(fā)明公開了一種用于鑒定凡納濱對蝦特定抗病品系的EST?SSR標記及其擴增引物和應用，屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明開發(fā)出9個具有高度多態(tài)性的凡納濱對蝦EST?STR標記，編號分別為Lv?Vp052、Lv?Vp054、Lv?Vp055、Lv?Vp058、Lv?Vp062、Lv?Vp066、Lv?Vp075、Lv?Vp076和Lv?Vp077，所述EST?SSR標記多態(tài)性強、雜合度高，在對抗病品系和普通品系的評估上具有優(yōu)勢；引物擴增穩(wěn)定、重復性好，因此本發(fā)明的EST?SSR標記及其擴增引物應可用于凡納濱對蝦抗病品系等種群鑒定、還可以用于遺傳多樣性分析，還可以用于優(yōu)良品種的輔助選育。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物分子標記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于鑒定凡納濱對蝦特定抗病品系的EST-SSR標記及其擴增引物和應用。

背景技術(shù)

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)俗稱南美白對蝦，原種分布于中南美洲從墨西哥到智利的太平洋沿岸海域，是典型的熱帶性對蝦。2020年我國凡納濱對蝦養(yǎng)殖年產(chǎn)量186萬多噸，占全國對蝦年產(chǎn)量的86％，蝦苗生產(chǎn)量15000多億尾，凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)已成為我國漁業(yè)發(fā)展的支柱性產(chǎn)業(yè)。然而近年來，凡納濱對蝦的養(yǎng)殖業(yè)受到了各種病害的侵擾，給整個產(chǎn)業(yè)造成不可挽回的損失。因此凡納濱對蝦育種工作的重點聚焦在抗病育種方面，而抗病育種的關(guān)鍵就是選擇具有高抗病力的個體進行后備親蝦種質(zhì)群體，如何快速準確地鑒定高抗病力的品系是我們研究的目標。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和遺傳學技術(shù)在水產(chǎn)領(lǐng)域的快速轉(zhuǎn)化，以性狀相關(guān)功能基因為基礎(chǔ)的分子標記技術(shù)成為水產(chǎn)遺傳育種的關(guān)鍵技術(shù)之一。表達序列標簽(ExpressedSequence Tag，EST)是對cDNA文庫隨機選擇的cDNA克隆進行大規(guī)模測序所獲得的SSR序列，反應mRNA的信息。EST-SSR標記的開發(fā)既可以節(jié)省傳統(tǒng)SSR所需的人力物力，又可以結(jié)合功能基因的注釋，從基因功能的角度開發(fā)標記。

因為EST-SSR來自于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，保守性比較高，具有方便、快捷、多態(tài)性分布等特點，因此廣泛應用在動植物的物種鑒定、遺傳分化等方面。本發(fā)明主要利用轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的凡納濱對蝦EST-SSR標記，對抗病成活率表現(xiàn)不同的品系進行鑒定，對凡納濱對蝦的抗病育種具有重大的應用價值。傳統(tǒng)的育種方法周期長、效率低。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和遺傳學技術(shù)在水產(chǎn)領(lǐng)域的快速轉(zhuǎn)化，以性狀相關(guān)功能基因為基礎(chǔ)的分子標記技術(shù)成為水產(chǎn)遺傳育種的關(guān)鍵技術(shù)之一。微衛(wèi)星序列(簡單重復序列Simple Sequence repeats，SSR；或稱短串聯(lián)重復序列short tandem repeats,STR)等分子標記技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標記輔助選育技術(shù)已成為當前水產(chǎn)育種的關(guān)鍵技術(shù)。目前基于抗菌EST(Expressed Sequence Tag)的SSR標記的開發(fā)較少。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種用于鑒定凡納濱對蝦特定抗病品系的EST-SSR標記及其擴增引物和應用。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明利用團隊構(gòu)建的凡納濱對蝦幼苗，在哈氏弧菌Vibrio harveyi感染下構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組文庫數(shù)據(jù)，構(gòu)建的測序文庫在華大基因有限公司(華大基因，深圳)的Illumina HiSeq 4000平臺(Illumina,San Diego,USA)進行測序。從數(shù)據(jù)庫獲得的凡納濱對蝦EST-SSR序列，開發(fā)凡納濱對蝦高度多態(tài)性EST-STR標記，并提供多態(tài)性引物，為凡納濱對蝦遺傳多樣性研究及優(yōu)良品種的輔助選育提供高度多態(tài)性的分子標記。

本發(fā)明從哈氏弧菌感染的凡納濱對蝦EST-SSR數(shù)據(jù)庫中根據(jù)功能預測和核心區(qū)重復差異的結(jié)果，選擇了29對引物對凡納濱對蝦的基因組DNA進行PCR擴增，其中有9對引物能穩(wěn)定擴增出目的條帶。采用3730xl設(shè)備檢測STR樣本，并用Genemapper軟件分析SSR數(shù)據(jù)，最終確定了9個引物結(jié)合可以用于特定凡納濱對蝦抗病品系的檢測。