[發(fā)明專利]本氏煙MTA基因在調(diào)控植物抗病毒中的應(yīng)用及轉(zhuǎn)基因植物培育方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210429525.1
• 申請(qǐng)日: 2022-04-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114891827B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李方方;周雪平;何浩;葛林豪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N15/29;A01H5/00;A01H6/82;A01H4/00;A01G22/45
• 代理公司: 北京東方尚禾專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11844
• 代理人: 李厚銘

1.本氏煙MTA基因在調(diào)控植物抗病毒中的應(yīng)用，其特征在于：所述病毒為鳳果花葉病毒，Pepino?mosaic?virus，PepMV；所述MTA基因的轉(zhuǎn)錄本序列如SEQ?ID?NO:1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述本氏煙MTA基因在調(diào)控植物抗病毒中的應(yīng)用，其特征在于：通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法，將MTA基因?qū)肽康闹参镏校@得的本氏煙MTA高表達(dá)植株能夠顯著減輕鳳果花葉病毒的侵染。

3.一種抗鳳果花葉病毒的MTA轉(zhuǎn)基因植物的培育方法，其特征在于：通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法，將MTA基因?qū)肽康闹参镏校@得本氏煙MTA基因高表達(dá)植物，所述MTA基因的轉(zhuǎn)錄本序列如SEQ?ID?NO:1所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的MTA轉(zhuǎn)基因植物的培育方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)本氏煙草葉片取樣，使用Trizol法抽提RNA，使用oligo(dT)₁₈引物，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；

(2)使用引物對(duì)NbMTA-F與NbMTA-R，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆得到NbMTA；

(3)將NbMTA構(gòu)建到帶有GFP熒光標(biāo)簽的載體上，獲得GFP-NbMTA重組質(zhì)粒；

(4)將1μl重組質(zhì)粒與100μl農(nóng)桿菌感受態(tài)混合轉(zhuǎn)入電擊杯中，使用電擊裝置2500V電擊轉(zhuǎn)化，恢復(fù)后涂布到抗性培養(yǎng)基上篩選獲得帶有GFP-NbMTA重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌；

(5)將帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染煙草葉片，經(jīng)分化培養(yǎng)獲得愈傷組織，再經(jīng)生根培養(yǎng)獲得小苗，轉(zhuǎn)移繼續(xù)培養(yǎng)；

(6)繼續(xù)培養(yǎng)的小苗生長(zhǎng)穩(wěn)定后，取葉片樣品，使用Trizol法抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；利用引物對(duì)q-NbMTA-F與q-NbMTA-R，以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，檢測(cè)植物中NbMTA的表達(dá)水平；

取少許葉片組織，放到激光共聚焦顯微鏡下觀察，檢測(cè)是否能收集到綠色熒光信號(hào)；以上樣品抽提總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，再使用GFP抗體進(jìn)行Western?blot確定植物表達(dá)了帶GFP熒光標(biāo)簽的GFP-NbMTA，對(duì)以上陽(yáng)性植株留種。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的MTA轉(zhuǎn)基因植物的培育方法，其特征在于：所述oligo(dT)₁₈引物序列為5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'，如SEQ?ID?NO:6所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的MTA轉(zhuǎn)基因植物的培育方法，其特征在于：所述NbMTA-F與NbMTA-R的序列如SEQ?ID?NO:2-3所示；

NbMTA-F：ATGCCAACTTTGTACAAAAAAGC；

NbMTA-R：TGCAAGGGCTGGATGGCAAATAATG。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的MTA轉(zhuǎn)基因植物的培育方法，其特征在于：所述q-NbMTA-F與q-NbMTA-R的序列如SEQ?ID?NO:4-5所示；

q-NbMTA-F：CAGTGTGTTTGTTAGAGAGAGTGCC；

q-NbMTA-R：TTCAGCAGCCGTATGCG。