[發明專利]一種II型草魚呼腸孤病毒VP6重組乳酸菌的構建和應用

有效

• 申請號: 202210427863.1
• 申請日: 2022-04-22
• 公開（公告）號: CN114908029B
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發明（設計）人: 尹紀元;王慶;石存斌;王楠;李家豪;王英英;李瑩瑩;張德鋒;莫緒兵
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C07K14/14;C12N15/46;C12N15/74;A61K35/744;A61K39/15;A61K39/39;A61P31/14;A61P7/04;C12R1/225
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 林德強

本發明公開了一種II型草魚呼腸孤病毒VP6重組乳酸菌的構建和應用，所述重組乳酸菌保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號是CCTCC NO：M2022323。通過相關檢測證明了重組乳酸菌可以通過口服免疫將抗原直接呈遞給消化道免疫系統中的抗原呈遞細胞，能夠刺激魚體同時產生局部黏膜免疫應答和系統免疫應答反應、提高魚體產生特異性和非特異性免疫應答反應。提高免疫后稀有鮈鯽在GCRV感染過程中存活率，相對存活率(RPS)為42.9％，飼喂L.lactis pNZ8148?VP6在GCRV感染過程中具有較好的生態防控效果。

技術領域

本發明屬于基因工程及分子免疫學技術領域，具體涉及一種II型草魚呼腸孤病毒VP6重組乳酸菌的構建和應用。

背景技術

草魚(Ctenopharyngodon idella)是我國產量最高的淡水養殖魚類，具有重要的經濟地位。然而死亡率高達80％的草魚出血病(Grass carp hemorrhagic disease,GCHD)頻繁爆發，但目前尚無有效的治療措施。GCHD由草魚呼腸孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)感染草魚引起，流行病學調查結果顯示目前主要的流行毒株的基因型是GCRV-II型。接種疫苗是保護草魚抵御GCRV感染的最有效方法。

GCRV病毒基因組由11條大小不同且不連續的雙鏈RNA節段組成，可編碼12種蛋白，包括7種為結構蛋白和5種為非結構蛋白。其中，結構蛋白VP1由GCRV S1節段編碼，推測具有病毒RNA轉錄時的甲基轉移酶活性(methylase)，參與病毒mRNA復制過程中的加帽，但免疫家兔后產生的抗體中和活性不高。VP2蛋白由GCRV S2節段編碼，推測具有RNA聚合酶活性。VP3蛋白由GCRV S3節段編碼，推測具有核苷水解酶活性和RNA解旋酶活性，主要參與病毒轉錄過程中的能量供應。通過重組桿狀病毒組裝的II型GCRV VP3、VP4和NS38 顆粒樣病毒免疫草魚后可產生免疫保護。但是同VP2類似，VP3免疫家兔后不產生中和抗體。Ⅱ型的GCRVVP4蛋白均由S6節段編碼，是主要的外衣殼蛋白，參與病毒基因組轉錄過程，并與病毒包涵體的形成有關。有研究表明，將可以表達GCRV VP4蛋白的枯草桿菌芽孢口服疫苗和DNA疫苗免疫草魚可產生特異性抗體并具有一定的免疫保護作用。Ⅱ型的GCRV VP5 蛋白由S5節段編碼，結構中具有一個呼腸孤病毒M2保守結構域，與病毒粒子進入宿主細胞過程有關，具有核苷水解酶活性但抗體無中和活性。VP6蛋白作為GCRV的核心蛋白，能連接內衣殼和外衣殼，具有較好中和活性，口服或注射疫苗均可使魚體產生特異性抗體，可有效抑制GCRV感染，有研究表明該蛋白與哺乳動物正呼腸孤病毒的δ2蛋白具有較高的相似性。VP7蛋白與不完整的VP5蛋白可以形成異源二聚體，構成GCRV的外衣殼，具有蛋白裂解作用，使用重組VP7蛋白或者DNA疫苗免疫草魚可以有效抵抗GCRV的感染。

疫苗接種是防治GCRV感染的最有效途徑，“草魚出血病組織勻漿滅活疫苗”雖然有效，但存在滅活不完全導致散毒的風險，并且保護率較低需要反復接種才能獲得理想的保護效果。草魚出血病減毒活疫苗只需要進行一次免疫就能夠獲得很好的保護效果，但是弱毒疫苗存在毒力返強的風險。此外無論是滅活疫苗還是弱毒疫苗都需要通過注射免疫使草魚獲得保護，操作繁瑣，不利于漁業生產中推廣使用。

口服疫苗是將抗原等包封或生物載體等技術處理之后，通過投喂含有免疫制劑的餌料，使疫苗進入魚體的消化道黏膜，通過刺激魚體腸道黏膜免疫系統來產生免疫應答。魚類口服接種疫苗不受時間、地點和魚體大小的限制，適用于大群體接種，操作方便、省時、省力，便于大規模推廣應用。但蛋白抗原在水體環境中穩定性差、利用率低，易被消化道內的蛋白酶降解，影響免疫保護效果。因此亟需一種可以有效免疫的口服制劑。

發明內容

本發明的目的在于以乳酸菌模式菌株作為載體，構建可以表達GCRV VP6蛋白的重組乳酸菌。而后經口服灌胃免疫稀有鮈鯽，通過活菌計數確定后腸組織中的重組乳酸菌的駐留情況，通過檢測免疫反應相關基因的表達水平、血清特異性抗體水平以及攻毒后對稀有鮈鯽的免疫保護率來評價疫苗的保護效果，以期開發一種安全有效的II型GCRV益生菌口服疫苗，為草魚的健康養殖提供保障。