[發明專利]一種降低烏菜小孢子再生植株褐化率的方法

在審

• 申請號: 202210425220.3
• 申請日: 2022-04-21
• 公開（公告）號: CN114982632A
• 公開（公告）日: 2022-09-02
• 發明（設計）人: 袁凌云;張利婷;汪承剛;張勝男;黃興學;朱世東;侯金鋒;唐小燕
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學;安徽省皖江蔬菜產業技術研究院有限責任公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 合肥興東知識產權代理有限公司 34148
• 代理人: 葉曼

本發明提供了一種降低烏菜小孢子再生植株褐化率的方法，步驟如下：待烏菜植株現蕾后，摘取花序；用酒精與HgCl₂消毒花蕾，并用無菌水沖洗；釋放出小孢子，經過濾、離心得純化小孢子；將小孢子用NLN培養基稀釋、分裝到培養皿，并添加0.5mg/g～4mg/g類黃酮和5μg/100g～40μg/100g角黃素；最后，熱激處理轉至黑暗培養，待出現胚狀體振蕩培養；將培子葉期胚狀體轉移到MS培養基上分化培養。本發明的優點在于：通過在小孢子培養基中同時添加類黃酮和角黃素這兩種成分來有效提高小孢子抗氧化能力，從而使胚胎發育再生植株的褐化率有效降低，為加快烏菜雜交育種速度、提高育種效率和種質創新提供強有力的基礎。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種降低烏菜小孢子再生植株褐化率的方法。

背景技術

烏菜(Brassica campesttris L.ssp.chinesis(L.)Makino var.rosularis Tsenet Lee)又名塌菜、塌棵菜、塌地松、黑菜等，為十字花科二年生蕓薹屬白菜(B.campestrisL.)的一個亞種，是十字花科的兩年生草本植物。烏菜原產于我國，富含礦物質和維生素，在秋季播種后經過霜雪，味道甜美，口感最佳，是白菜中的珍品。

小孢子是高等植物雄配子體減數分裂后四分體釋放出的單核細胞。游離小孢子培養是指直接從花蕾或花藥中獲得小孢子群體進行培養的方法。小孢子培養技術已經普遍應用在很多植物中，與傳統育種方法相比，通過小孢子培養可快速獲得各種純合基因，因此對由多基因控制的特異性狀的篩選能一步到位，大大提高選擇機率，加快育種進程。小孢子培養技術還被廣泛應用于誘變育種、種質創新、構建群體進行基因定位、作圖及遺傳分析領域當中。

目前，小孢子的游離培養在多種作物中獲得成功，尤其是十字花科蔬菜的研究成績斐然。然而，迄今為止，小孢子的游離培養在理論和實踐中仍然存在一些問題，主要表現在“胚狀體再生過程中褐化情況嚴重”這一方面。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種降低烏菜小孢子再生植株褐化率的方法，其通過在小孢子培養基中同時添加類黃酮和角黃素這兩種成分來提高小孢子抗氧化能力，從而使胚胎發育再生植株的褐化率有效降低。

本發明采用以下技術方案解決上述技術問題：

一種降低烏菜小孢子再生植株褐化率的方法，包括如下步驟：

(1)花序的選擇

待烏菜植株現蕾后，摘取花序，備用；

(2)小孢子分離

選取花瓣長度與花藥長度之比在0.5～1之間的花蕾，用70％酒精與0.1％HgCl₂進行組合消毒，棄廢液后再用無菌水沖洗；接著，在B5培養基中研碎花蕾釋放出小孢子，并先后使用鋼絲網篩和細胞網篩過濾；再接著，收集濾液于離心管進行離心；離心后，用B5培養基重懸沉淀后再次離心，所得沉淀即為所需的純化小孢子；

(3)小孢子培養

將純化小孢子用NLN培養基稀釋，并調整細胞密度為1×10⁵～2×10⁵個/mL；接著，將稀釋后的純化小孢子分裝到培養皿中，并添加0.5mg/g～4mg/g濃度的類黃酮和5μg/100g～40μg/100g濃度的角黃素；最后，在33℃下熱激處理24h后轉至25℃下黑暗培養，待出現肉眼可見的胚狀體后，置于搖床上振蕩培養；

(4)胚狀體萌發及成苗

將培養好的子葉期胚狀體轉移到MS培養基上進行分化培養，直至培養成苗。

作為本發明的優選方式之一，所述步驟(1)中，選擇的花序具體為盛花期無蟲害且無裂蕾的植株主花序或一級分支的健康花序。