[發明專利]無內毒素質粒快速提取試劑盒及質粒提取方法

在審

• 申請號: 202210425000.0
• 申請日: 2022-04-22
• 公開（公告）號: CN114621950A
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 程建祥;任光琳;徐宜鐵;韓小東;王芮
• 申請（專利權）人: 山東思科捷生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 青島清泰聯信知識產權代理有限公司 37256
• 代理人: 張潔

本發明提出一種無內毒素質粒快速提取試劑盒及質粒提取方法，屬于分子生物學領域，能夠解決現有的內毒素去除方法存在操作復雜、成本高、去除效果差且有RNA殘留的技術問題。其中，本發明無內毒素質粒快速提取試劑盒包括裂解試劑組、雜質去除試劑、內毒素清除試劑、洗脫試劑組和至少一個吸附柱；質粒提取方法包括：樣品重懸與裂解、內毒素清除、雜質去除、雜質漂洗和質粒DNA洗脫步驟。利用本發明的無內毒素質粒快速提取試劑盒提取的質粒內毒素含量低于0.1EU/μg，能夠滿足細胞轉染、基因治療、基因工程等需較低水平內毒素的實驗和研究要求。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，尤其涉及一種無內毒素質粒快速提取試劑盒及質粒提取方法。

背景技術

質粒DNA的提取純化是現代分子生物學研究和應用中最基本且尤為關鍵的實驗技術之一，高純度的質粒DNA是基因克隆、基因序列分析的重要前提，尤其是涉及核酸疫苗、基因治療等對內毒素含量要求極高的研究領域尤為關鍵。

本領域最常用的提取質粒方法是堿裂解法，該方法是分子克隆研究中最常用的方法之一。內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁外膜的主要成分脂多糖，細菌裂解時會隨之釋放出來，該物質能顯著降低內毒素敏感細胞株的轉染效率，因此，利用常規試劑盒提取的質粒DNA無法滿足細胞轉染、基因治療、基因工程等需較低水平內毒素的實驗和研究。目前，內毒素去除策略有兩種：一是在質粒DNA結合階段去除；二是在質粒DNA洗脫后去除，其中，去除方法主要有液相分離法和固相介質法，如分子篩等。但是，目前市場上液相分離法的優點是成本低，但去內毒素效果差且有RNA殘留；而固相介質法成本高，操作復雜，優點是去內毒素效果好，可見，現有的內毒素去除方法各有優劣。

因此，對于無內毒素高純質粒DNA提取而言亟需一款成本低、純度高、效率高、去內毒素效果佳的試劑盒。

發明內容

本發明針對現有的內毒素去除方法存在操作復雜、成本高、去除效果差且有RNA殘留的技術問題，提出一種無內毒素質粒快速提取試劑盒及質粒提取方法，具有成本低、純度高、提取效率高且去內毒素效果佳等特點。

為了達到上述目的，本發明采用的技術方案為：

無內毒素質粒快速提取試劑盒，包括裂解試劑組、雜質去除試劑、內毒素清除試劑、洗脫試劑組和至少一個吸附柱；

其中，所述內毒素清除試劑含有pH＝6.5-7.5、濃度為10-200mmo/L的Tris-HCl緩沖液、濃度為10-200mmo/L氯化鈉、體積分數為10％-20％的Triton X-114、質量體積比為0.0001％-0.005％的溴酚藍。

在一實施方式中，裂解試劑組包括菌體重懸劑、堿性裂解液和中和溶液。

在一實施方式中，菌體重懸劑含有pH＝8.0、濃度為20-50mM的Tris-HCl緩沖液、pH＝8.0，25℃，濃度為10-20mM的EDTA，濃度為100mg/mL的RNase A；

堿性裂解液含有濃度為150-200mM的NaOH和1％-10％的SDS；

中和溶液含有濃度為4-6M的鹽酸胍和pH＝4.2，濃度為0.5-1.0M的醋酸鉀溶液。

在一實施方式中，雜質去除試劑為去蛋白液，其含有pH＝7.0-7.5，濃度為4-6M鹽酸胍、濃度為10-200mM的Tris-HCl緩沖液和體積分數為40％-60％的異丙醇。

在一實施方式中，洗脫試劑組包含漂洗液和洗脫液。

在一實施方式中，漂洗液含有pH＝7.0-7.5，濃度為10-100mM的氯化鈉、濃度為10-100mM的Tris-HCl緩沖液、體積分數為50％-80％的無水乙醇；

洗脫液含有pH＝8.0-8.5，濃度為0.01-0.1mM的EDTA和濃度為10-100mM的Tris-HCl緩沖液。