[發明專利]一種用于檢測G-CSFR的流式檢測試劑及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202210423390.8
• 申請日: 2022-04-21
• 公開（公告）號: CN114755165A
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發明（設計）人: 張穎;婁世鋒;王滕;白鳳霞;張萍
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學附屬第二醫院
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14;G01N33/52
• 代理公司: 重慶志合專利事務所(普通合伙) 50210
• 代理人: 胡榮琿

本發明提供一種用于檢測G?CSFR的流式檢測試劑，其有效成分為連接有熒光素的人源重組G?CSF。本發明還提供了相應的制備方法，以及基于該流式檢測試劑制備的檢測試劑盒。本發明彌補了現有流式檢測以抗體為主的缺陷，填補了現有技術空白，具有良好的應用前景。

技術領域

本發明涉及醫學診斷技術領域，具體涉及用于檢測G-CSFR的流式檢測試劑及其制備方法和應用。

背景技術

粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)是由單核細胞和巨噬細胞產生的一種細胞生長因子，通過與效應細胞表面特異性受體G-CSFR結合，激活復雜的信號轉導系統，發揮多種生物學功能，包括調節髓系細胞的增殖、分化與存活。目前，在臨床上G-CSF廣泛應用于粒細胞減少性疾病及化療后粒細胞缺乏的病征，G-CSF也是自體或異基因移植時外周血干細胞強有力的動員劑，而且G-CSF聯合化療的預激方案在治療難治、復發、老年的急性髓系白血病及骨髓增生異常綜合癥中也取得良好療效。

G-CSFR是一種高親和力受體，分布于髓系定向造血祖細胞、中性粒細胞、內皮細胞、髓系白血病細胞、部分幼稚淋巴細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞以及某些非造血細胞。正常情況下，G-CSFR與G-CSF結合，能夠促進髓系前體細胞的生長和維持，促使髓細胞最終分化成粒細胞。但G-CSFR的異常表達、基因突變等會導致G-CSF的信號轉導紊亂，通常與惡性先天性中性粒細胞減少癥、急性髓系白血病、慢性中性粒細胞白血病、非典型慢性粒細胞白血病等疾病的發生、發展密切相關。近年來，隨著分子遺傳學以及臨床研究的深入，對于G-CSFR的異常表達或基因突變在相關血液病發病以及治療中的具體作用的研究取得較多新進展。但是，由于檢測手段的局限、患者的多樣性、血液腫瘤細胞的生物學及遺傳學的異質性等因素，有關G-CSFR的一些研究報道尚存在爭議，G-CSFR與臨床診斷、治療以及預后的關系尚待深入的探討。

流式技術是經典的單細胞檢測技術，能夠對細胞表面標志物進行多參數檢測。傳統流式使用熒光基團偶聯抗體，基于抗體與細胞表面抗原特異性結合的特性，利用熒光光路，檢測細胞表面標志物。但是該技術也有局限，即細胞表面抗原產生突變，則可能導致其與相應抗體結合失效，致使流式技術無法檢測出細胞表面標志物與抗體結合的信號。目前市場上的流式檢測試劑均為抗體制備，均無法避免抗原突變問題，這極大的限制了醫學研究及臨床應用。

發明內容

本發明針對上述現有技術中存在的技術問題，提供了一種以細胞因子G-CSF為基礎的檢測G-CSFR的流式檢測試劑。細胞因子多為低分子質量的蛋白質或糖蛋白，與細胞因子受體間呈高親和力，是抗原抗體親和力的100-1000倍，且兩者之間的結合是完整結合，受體發生突變對兩者之間結合并無影響。該試劑很好的彌補了現有流式檢測以抗體為主的缺陷，填補了現有技術空白，具有良好的應用前景。

本發明首先提供了一種用于檢測G-CSFR的流式檢測試劑，有效成分為連接有熒光素的人源重組G-CSF；所述熒光素選自異硫氰酸熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)或別藻藍蛋白(APC)中的任一種。

在根據本發明的一個實施方案中，所述人源重組G-CSF的氨基酸序列為SEQ IDNO:1。

序列SEQ ID NO:1

在根據本發明的一個實施方案中，還包含溶劑，所述溶劑為PBS。

本發明還提供了上述的流式檢測試劑的制備方法，包括：

1)將FITC試劑與MES混合，混勻后得到FITC濃度為10mg/mL的混合液；

2)向所述混合液中加入過量的EDC和NHS，混勻并于室溫反應15min；

3)加入巰基乙醇，終止EDC活化反應，并調pH至7.2，得到活化的混合液；