[發明專利]一種α-半乳糖苷酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 202210419086.6
• 申請日: 2022-04-20
• 公開（公告）號: CN114752581B
• 公開（公告）日: 2023-05-26
• 發明（設計）人: 吳斌;王佳玲;韋利軍;高振;儲建林;何冰芳
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N9/40
• 分類號: C12N9/40;C12N15/56;C12P19/44
• 代理公司: 南京艾普利德知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32297
• 代理人: 張鉑

本發明公開了一類高比活的α?半乳糖苷酶突變體及其應用。本發明以來源于Anoxybacillus?vitaminiphilus的α?半乳糖苷酶AgaV為模板，采用分子生物學技術進行氨基酸突變，得到一類催化效率提高的突變體，包括G355D、G355E、G355F、G355H、G355I、G355K、G355L、G355N、G355Q、G355R、G355T、G355V和G355Y。本發明所述的突變體具有催化效率高的優良性質，對以D?半乳糖和甘油為底物催化合成異紅藻苷的效率提高了1.3?3倍，有利于降低異紅藻高合成的成本，提高了使用該酶生產異紅藻苷的轉化效率，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于功能基因改造技術領域，具體涉及一類α-半乳糖苷酶突變體及其應用。

背景技術

半乳糖基-甘油是一種由D-半乳糖基和甘油組成的醇溶性半乳糖苷，存在于許多紅藻和海藻類當中。α-D-半乳糖基-甘油和β-D半乳糖基-甘油廣泛用于化妝品、保健品、食品和藥物。一般，α-D-半乳糖基-甘油有兩種對映體形式：紅藻糖苷和異紅藻苷，在藻細胞中主要發揮抗滲透壓等作用，同時具有化學抗氧化、抗炎、免疫調節及清除自由基等作用。研究表明，異紅藻苷是紅藻的主要光合產物，紅藻(海蘿和壇紫菜)已被證實含有高濃度的異紅藻苷。

目前，異紅藻苷尚未有化學合成法，主要采用醇提工藝從紅藻中獲得，但是這種方法存在提取工藝復雜，效率低等問題。

利用α-半乳糖苷酶催化甘油和D-半乳糖逆水解反應合成異紅藻苷具有原子經濟性高、成本低等優點，并且結合蛋白質工程手段提高α-半乳糖苷酶酶活對提高異紅藻苷的產量具有重要意義。

發明內容

本發明通過定點飽和突變對來源于維生素芽孢桿菌Anoxybacillusvitaminiphilus的α-半乳糖苷酶進行理性改造，獲得一系列α-半乳糖苷酶突變體，可以作為生物催化劑，催化底物甘油和D-半乳糖逆水解反應，生產異紅藻苷，提高異紅藻苷的轉化率。

本發明具體技術方案如下：

一種α-半乳糖苷酶突變體，在SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列基礎上具有G355突變，第355位的甘氨酸突變為天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、蘇氨酸、纈氨酸或酪氨酸。

優選第355位的甘氨酸突變為組氨酸。本發明另一目的在于提供一種DNA分子，所述DNA分子編碼本發明所述的α-半乳糖苷酶突變體。

本發明另一目的在于提供一種α-半乳糖苷酶突變體的表達載體，表達如本發明所述的α-半乳糖苷酶突變體。所述表達載體，含有編碼本發明所述的α-半乳糖苷酶突變體的DNA分子。所述表達載體為質粒、噬菌體、病毒或宿主細胞。

所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞，可以為大腸桿菌、酵母、芽孢桿菌、乳酸桿菌、曲霉或木霉，優選大腸桿菌。

本發明另一目的是提供上述α-半乳糖苷酶突變體、DNA分子或α-半乳糖苷酶突變體的表達載體在制備異紅藻苷中的應用。

綜上所述，本發明優點如下：本發明以來源于Anoxybacillus?vitaminiphilus的α-半乳糖苷酶AgaV(核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示)為模板，采用計算機輔助設計尋找潛在的氨基酸活性位點，共得到四個潛在的位點：I348、I591、V618和G355。進一步對這4個位點進行飽和突變，考察各突變體的酶活和合成異紅藻苷的相對轉化率。研究結果顯示，I348、I591、V618飽和突變的突變體，對異紅藻苷的轉化率均沒有顯著提高，G355位點的若干突變體具有催化效率高的優良性質，對以D-半乳糖和甘油為底物催化合成異紅藻苷的效率提高了1.3-3倍，其中G355H對異紅藻苷的轉化率提升幅度最為顯著，為原始酶的3倍。本發明有利于降低異紅藻高合成的成本，提高使用該酶生產異紅藻苷的轉化效率，大大降低了生產成本，具有重要的應用價值。

附圖說明