[發(fā)明專利]一種pSFV-flagX-CMV復制子質粒、制備方法和雞尾酒混合疫苗

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210412508.7
• 申請日: 2022-04-19
• 公開（公告）號: CN115094088A
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發(fā)明（設計）人: 陳瑞愛;黃梅;鄭航輝;方倪冉;劉定祥;楊小云;董楠
• 申請（專利權）人: 華南農業(yè)大學;華農（肇慶）生物產業(yè)技術研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;C12N15/65;C12N15/34;A61K39/12;A61P31/20;A61P31/14
• 代理公司: 廣州市科豐知識產權代理事務所(普通合伙) 44467
• 代理人: 羅嘯秋

本發(fā)明屬于生物工程技術領域，公開了一種pSFV?flagX?CMV復制子質粒，采用含塞姆利基森林病毒復制子的載體，并將p54，p22，p32，p72，pCD2v，M448R，MGF505?7R和M1249L基因分別插入所述載體而得；所述p54，p22，p32，p72，pCD2v，M448R，MGF505?7R基因序列依次如SEQ ID NO.15?NO.21所示。該質粒通過插入非洲豬瘟抗原基因(X)，制得的pSFV?flagX?CMV復制子質粒在真核細胞能夠高效表達ASFV抗原蛋白，有利于非洲豬瘟雞尾酒DNA疫苗的研制，也有利于通過Flag抗體膠對這些蛋白進行純化，制取有別于原核表達的，具備翻譯后修飾的高質量抗原蛋白；同時，本發(fā)明還公開了該質粒的制備方法和雞尾酒混合疫苗。

技術領域

本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種pSFV-flagX-CMV復制子質粒、制備方法和雞尾酒混合疫苗。

背景技術

非洲豬瘟(ASF)是一種病毒性出血病，對家豬和歐亞野豬的致死率極高。近年該病已從歐洲傳播至我國及其周邊諸國。迄今對該病仍然缺乏安全和有效的疫苗防控，一經發(fā)現(xiàn)只能大規(guī)模撲殺，造成不可估量的經濟損失和社會影響。盡管多個基因缺陷型活疫苗的研究成果已展示了良好的免疫保護效力，但其保護力仍不完全。尤其是免疫功能低下的動物可因接種此類疫苗成為新的病毒攜帶者和傳播者。為此目前對非瘟活疫苗的使用尚未推廣。迄今的研究結果表明，滅活病毒疫苗對該病不能提供保護。蛋白亞單位疫苗因其不能刺激有效的細胞免疫反應，不能有效祛除細胞內的病毒而受到局限。已有研究表明單純的中和性抗體并不能完全阻止ASFV病毒的復制和擴散。目前的DNA疫苗結果也僅顯示部分保護作用。病毒載體疫苗也還處于研發(fā)階段，有可能成為對抗ASFV的武器。

塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus，SFV)復制子DNA是一種能在真核細胞內進行有限自我復制的表達系統(tǒng)。其攜帶的目的基因能通過載體所攜帶的復制酶基因產物的作用下進行大量復制，因此具更高的抗原蛋白表達能力。SFV復制子DNA含大量CpG序列，從而具有較強的刺激天然免疫反應的效力。因此基于SFV復制子的DNA疫苗不需要添加任何佐劑就能激發(fā)較強的細胞免疫和體液免疫反應。基于SFV的載體己用于抗多種感染性疾病(包括人和畜)的疫苗研究。其中人用疫苗已進入臨床前期和臨床期(抗癌)。在動物疫苗方面， SFV載體已應用于禽獸疫苗的研發(fā)，其中包括豬流感，豬水泡病毒(SVDV)，豬瘟病毒(CSFV) 等豬源病毒的免疫研究，并顯示有很好的攻毒保護效力。

非洲豬瘟病毒(ASFV)屬雙鏈大DNA病毒，結構非常復雜。病毒粒子結構由內到外分別為核質體、核衣殼、囊膜(分為外層與內層)：核質體主要由病毒基因組、DNA結合蛋白(p10、 p14、p37、p34等)及基因早期轉錄所需的酶組成；核衣殼主要含有結構蛋白p72和p17，由大約2000個殼粒組成；內側囊膜來源于宿主的內質網，結合著p12、p22、p32、p54及CD2v 蛋白，外層囊膜為病毒出芽附帶產物，松散環(huán)繞在四周。ASFV全基因組約為170–190kbp，含151到167個開放閱讀框。迄今用質譜和免疫電鏡進行蛋白鑒定已發(fā)現(xiàn)68種病毒蛋白，其中54種是結構蛋白，23種是病毒粒子的重要組成部分。

本案要解決的技術問題是：如何開發(fā)出一種能夠讓真核細胞能夠高效表達ASFV抗原蛋白的質粒，以為開發(fā)非洲豬瘟雞尾酒DNA疫苗做出準備。

發(fā)明內容

針對以上現(xiàn)有技術存在的缺點和不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種 pSFV-flagX-CMV復制子質粒；該質粒通過插入非洲豬瘟抗原基因(X)，制得的 pSFV-flagX-CMV復制子質粒在真核細胞能夠高效表達ASFV抗原蛋白，有利于非洲豬瘟雞尾酒DNA疫苗的研制，也有利于通過Flag抗體膠對這些蛋白進行純化，制取有別于原核表達的，具備翻譯后修飾的高質量抗原蛋白；同時，本發(fā)明還公開了該質粒的制備方法和雞尾酒混合疫苗。

本發(fā)明目的通過以下技術方案實現(xiàn)：