[發(fā)明專利]豬流行性腹瀉病毒Nsp15蛋白的多克隆抗體及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210411692.3
• 申請日: 2022-04-19
• 公開（公告）號: CN114773458A
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金寧一;李昌;李樂天;宋利娜;魯會軍;李霄;田明堯;郝鵬飛
• 申請（專利權(quán)）人: 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/06;C07K14/165;C12N15/70;C12N1/21;G01N33/569;G01N33/68;C12R1/19
• 代理公司: 北京一枝筆知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11791
• 代理人: 張慶瑞

本發(fā)明涉及一種豬流行性腹瀉病毒Nsp15蛋白的多克隆抗體及其制備方法。本發(fā)明成功構(gòu)建了豬流行性腹瀉病毒Nsp15蛋白的原核表達質(zhì)粒，并摸索出37℃為最佳誘導(dǎo)溫度，通過鎳柱純化得到高純度Nsp15蛋白，純度高達90％，蛋白濃度為0.69mg/mL，進而制備得到了效價較高的Nsp15蛋白多克隆抗體，抗體效價為2×10⁵，WesternBlot試驗驗證Nsp15陽性血清特異性較好，可用于檢測豬流行性腹瀉病毒與Nsp15的功能機制研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種豬流行性腹瀉病毒Nsp15蛋白的多克隆抗體及其制備方法。

背景技術(shù)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)于1971年發(fā)現(xiàn)于英國，是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染引起的一種豬的嚴(yán)重腹瀉性傳染病。PEDV一般通過直接或間接的糞口途徑傳播。在某些情況下，空氣傳播也可能在PEDV傳播中發(fā)揮作用。PEDV主要通過腹瀉糞便或嘔吐物傳播，也可通過臨床或亞臨床感染的豬、運輸豬糞便或食物的工具、主人、訪客等傳播。其他污染源，如環(huán)境中的微生物、食品、飼料、母豬奶等都可能是病毒的潛在傳播途徑。新生仔豬由于母源抗體低下導(dǎo)致自身免疫力低下，對PEDV極為易感，并呈現(xiàn)出極高的病死率。目前，豬流行性腹瀉成為世界上最具毀滅性的豬病毒性疾病之一，造成全球豬肉行業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。

PEDV可感染所有年齡階段的豬，其臨床癥狀為水樣腹瀉、嘔吐、厭食和抑郁。新生仔豬發(fā)病率接近100％，但母豬的發(fā)病率不盡相同。根據(jù)發(fā)病豬場調(diào)查，PEDV通常的潛伏期約1-8天。豬場感染PEDV的豬糞便可在48小時內(nèi)檢測到病毒核酸，4周內(nèi)都可能檢測得到病毒核酸。1周齡仔豬感染PEDV后出現(xiàn)嚴(yán)重的水樣腹瀉和嘔吐癥狀，癥狀維持3-4天，隨后出現(xiàn)嚴(yán)重脫水和電解質(zhì)失衡，最終導(dǎo)致死亡。1-3日齡仔豬死亡率接近100％。主要的癥狀出現(xiàn)在胃腸道，其特征是胃膨脹，內(nèi)有未消化的乳凝塊，腸壁薄而透明的，并伴有黃色液體。PEDV組織學(xué)特征主要是嚴(yán)重的彌漫性萎縮性腸炎、淺表絨毛細胞腫脹，伴有輕度細胞質(zhì)空泡化，以及含有凋亡細胞的絨毛固有層皺縮。這過程阻礙了豬體對營養(yǎng)物質(zhì)和電解質(zhì)的消化和吸收，導(dǎo)致產(chǎn)生消化不良和腹瀉等癥狀，最后仔豬出現(xiàn)嚴(yán)重和致命的脫水死亡。

PEDV蛋白中，發(fā)現(xiàn)有11種抑制干擾素的產(chǎn)生，包括Nsp1、Nsp3、Nsp7、Nsp14、Nsp15、Nsp16、E、M、N、ORF3。其中Nsp1是最有效的IFN拮抗劑，PEDVNsp1可以阻斷IRF1的核易位并減少過氧化物酶體的數(shù)量，減少的過氧化物酶體和抑制IRF1介導(dǎo)的IFN-λ依賴于PEDV Nsp1的保守氨基酸。PEDVNsp1不干擾IRF3磷酸化和核易位，但是通過降解CREB結(jié)合蛋白(CBP)，中斷了IRF3和CBP的增強體組裝，PEDVNsp1通過降解CBP和抑制ISGs來調(diào)節(jié)宿主的先天免疫。PEDVNsp1也阻礙NF-κB核易位，這不僅影響干擾素的產(chǎn)生也會影響炎癥因子的產(chǎn)生，如：TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-15，IL-17。

PEDV Nsp3的PLP2結(jié)構(gòu)也通過阻止RIG-I和STING介導(dǎo)的I型IFN活化而抑制固有免疫。PEDV PLpro域中的PLP2結(jié)構(gòu)也通過阻止RIG-I和STING介導(dǎo)的I型IFN活化，這一機制主要是阻止了RIG-I 63位賴氨酸泛素化修飾，而63位賴氨酸鏈泛素化修飾對RIG-I介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要。PEDVNsp5通過裂解NF-κB必不可少的適配器NEMO(或IKKγ)從而抑制NF-κB IRF3核易位，最終抑制IFN-β生產(chǎn)。PEDV NSP9的晶體結(jié)構(gòu)解析是發(fā)現(xiàn)，Nsp9二聚化可以增強核酸結(jié)合力，有助于與核酸結(jié)合，利于其復(fù)制。PEDV Nsp16下調(diào)RIG-1和MDA5從而抑制IFN-β和ISRE活性，可促進病毒增殖。此外，Nsp10可以增強IFN-βNsp16的抑制效果。PEDV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp12是一種RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase，RdRp)，是病毒復(fù)制、增殖的關(guān)鍵復(fù)制酶。PEDVNsp12蛋白能夠與宿主細胞蛋白RNF7相互作用，其具體作用機制不明。