[發明專利]一種黃鱔生殖細胞異種移植及移植后嵌合性腺的檢測方法

有效

• 申請號: 202210411188.3
• 申請日: 2022-04-19
• 公開（公告）號: CN114592075B
• 公開（公告）日: 2023-09-15
• 發明（設計）人: 陶彬彬;張西婭;宋焱龍;羅紅瑞;陳戟;胡煒
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6848;C12N15/11;C12N5/075;C12N15/89;G01N15/14;A01K61/10;A01K61/95
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

1.一種黃鱔生殖細胞異種移植及移植后嵌合性腺的檢測方法，包括下述步驟：

1)注射可阻斷鯉魚或斑馬魚dnd?mRNA翻譯的morpholino?至鯉魚或斑馬魚受精卵，將生殖細胞剔除的鯉魚或斑馬魚幼魚作為黃鱔生殖移植的受體魚；

2)注射活體熒光標記至1細胞期黃鱔胚胎，挑選帶有熒光標記的黃鱔胚胎；選取卵黃后方的胚胎組織，利用含有0.05~0.3%膠原蛋白酶V和0.5-2%檸檬酸鈉的Ringer平衡鹽溶液對剪去的黃鱔胚胎組織消化，每間隔10~30分鐘用5ml、10ml或20ml無菌注射器輕輕吹打2~10次，酶消化總時間不超過2小時，利用孔徑70μm或100μm細胞篩濾去未解離的組織塊，2000rpm離心3~8分鐘，用含有胎牛血清的PBS溶液重懸細胞后用40μm或70μm細胞篩再次過濾后保留濾液，并在顯微鏡下觀察確認濾液是否為外觀完整的單細胞懸液；利用流式細胞儀對符合要求的單細胞懸液進行熒光分選，獲得的GFP陽性細胞即為黃鱔原始生殖細胞，將黃鱔原始生殖細胞通過玻璃針注射到到內源生殖細胞剔除的鯉魚或斑馬魚幼魚性腺原基處，獲得嵌合黃鱔生殖細胞的受體魚；

3)提取黃鱔生殖細胞移植后1~12月齡的受體鯉魚或斑馬魚性腺總RNA，逆轉錄為cDNA；

4)以步驟3）得到的cDNA為模板，通過巢式PCR擴增黃鱔生殖細胞特異表達的dazl基因序列；?PCR巢式PCR第一輪的引物為eel-dazl-F1：?5’-AGTATGCCCTCCTTTCTCCT-3’,?eel-dazl-R1：?5’-AATTGATGCCTTGATTGTCC-3’；第二輪PCR以第一輪PCR反應的產物為模板，引物序列：eel-dazl-F2：?5’-CAGAGCACCCTCACCATACC-3’,?eel-dazl-R2?：5’-GAATAGCCGAAAGCCCTTAT?-3’；

第一輪PCR后擴增得到的黃鱔dazl片段為744bp,第二輪PCR后擴增得到的黃鱔dazl片段為355bp；表明受體魚性腺中存在整合的黃鱔生殖細胞。

2.根據權利要求1所述的方法，所述的鯉魚morpholino為：5’-cctgctgtagctgctgtccctccat-3’；

斑馬魚的morpholino為：5’-gctgggcatccatgtctccgaccat-3’。

3.根據權利要求1所述的方法，步驟2）中含有胎牛血清的PBS中，胎牛血清和PBS的體積比是2%。

4.權利要求1所述的方法在黃鱔商業養殖中的應用。