[發明專利]一類用于蛋白質半胱氨酸殘基修飾的含氟標簽及應用

在審

• 申請號: 202210402758.2
• 申請日: 2022-04-15
• 公開（公告）號: CN115991669A
• 公開（公告）日: 2023-04-21
• 發明（設計）人: 李從剛;柴兆斐;吳瓊;成凱;劉曉黎;張則婷;姜凌;劉買利
• 申請（專利權）人: 中國科學院精密測量科學與技術創新研究院
• 主分類號: C07D213/71
• 分類號: C07D213/71;C07D213/85;C07D215/36;G01N24/08
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 江麗麗

本發明屬于蛋白質修飾技術領域，具體公開了一類用于蛋白質半胱氨酸殘基修飾的含氟標簽及應用。本發明利用砜基化合物與巰基的特異性反應構建了水溶性¹⁹F標簽，該標簽能夠在溫和條件下實現半胱氨酸殘基的修飾，形成穩定的碳硫鍵，標記的蛋白質有效地降低了蛋白質的核磁共振檢測濃度，并且可以用于細胞內的研究。

技術領域

本發明屬于蛋白質化學修飾技術領域，具體涉及到利用砜基含氟化合物特異性地與蛋白質中的巰基反應，利用核磁共振進行多肽或蛋白質結構、動態及相互作用的研究。

背景技術

生物體內幾乎不含游離的氟元素，因此氟標記的蛋白質(或多肽)能夠在沒有背景干擾的情況下進行檢測。目前，氟代氨基酸(前體)的生物合成仍然是獲取氟標蛋白質的有效方法。但是多氟標記可能影響蛋白質的折疊過程、表達效率或穩定性等。位點特異性化學標記可以作為生物標記的有利補充，能夠為難以重組表達、分子量超大或復雜系統的蛋白質提供有力標記工具。

但是目前用于¹⁹F化學標記的標簽仍然存在一些問題，一方面這些化合物難以修飾，基本上屬于脂溶性，需要大大過量或加入有機溶劑促溶才能實現高效連接；另一方面，蛋白質與標簽形成的化學鍵在細胞環境下不穩定或形成異構體，影響信號歸屬。針對上述問題，本發明利用砜基與巰基的特異性反應，設計了含氟標簽，既能夠與蛋白質在溫和的條件下實現高效率的連接，又可以通過離去基團的改造，構建水溶性的標簽。結果顯示，標記的蛋白質有效地降低了蛋白質的核磁共振檢測濃度，并且可以用于細胞內的研究。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供了一類用于蛋白質半胱氨酸殘基修飾的含氟標簽及應用，利用砜基化合物與巰基的特異性反應構建了水溶性¹⁹F標簽，該標簽能夠在溫和條件下實現半胱氨酸殘基的修飾，形成穩定的碳硫鍵，標記的蛋白質有效地降低了蛋白質的核磁共振檢測濃度，并且可以用于細胞內的研究。

為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：

含氟標簽，具有如下結構：

其中，為含三氟甲基單元的拉電子芳香環，包括：

所述標簽的具體結構如下：

上述含氟標簽在多肽或蛋白質標記中的應用：所述多肽或蛋白質含有半胱氨酸，含氟標簽與半胱氨酸殘基反應形成穩定的碳硫鍵，標記后的多肽或蛋白質能夠用于氟-19核磁共振(¹⁹F?NMR)研究。在本發明的具體實施例中，將含氟標簽(標簽1-4)對GB1蛋白質(鏈球菌的免疫G蛋白B1結構域)進行標記，通過質譜Q-TOF發現4個標簽與GB1蛋白質的連接效率接近100％，尤其是標簽1含有六個等價氟原子，比其它標簽的信號增強能力更大，并驗證了標簽1在其它蛋白質標記中的普適性(鈣調蛋白，CaM；泛素蛋白，UBQ；麥芽糖結合蛋白，MBP)，還可用于細胞內蛋白質的檢測。

上述含氟標簽在含巰基的小分子標記中的應用：含氟標簽可與巰基發生反應，氟的化學位移發生變化。在本發明的具體實施例中，含氟標簽(標簽1-4)與谷胱甘肽反應，通過核磁氟譜可用于含巰基的小分子的檢測。

與現有技術相比，本發明具有以下優點：

本發明可以實現含氟標簽水溶性的改造，避免標記過程中有機試劑或大量標記試劑對蛋白質結構造成影響；能夠在溫和條件下實現半胱氨酸殘基的修飾，形成穩定的碳硫鍵；能夠實現哺乳動物細胞內蛋白質的觀測，將其檢測濃度降低至微摩爾及以下，接近生理濃度。

附圖說明

圖1為標簽1-4與谷胱甘肽(GSH)的反應速度比較。

圖2為標簽1-4與GSH反應之后的¹⁹F?NMR譜。