[發明專利]一種呼吸道細菌聯合檢測裝置及其制備方法

有效

• 申請號: 202210402234.3
• 申請日: 2022-04-17
• 公開（公告）號: CN115015542B
• 公開（公告）日: 2023-02-28
• 發明（設計）人: 王洪波
• 申請（專利權）人: 吉林迅準生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/558;G01N33/68;G01N33/543
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 魏征驥

1.一種呼吸道細菌聯合檢測裝置的制備方法，其特征在于，包括下列步驟：

（a）氧化鋅-殼聚糖-膠體金制備

1）N-羧乙基殼聚糖的合成：將4.0g殼聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL 水中，在50℃下，持續攪拌2天，反應完成后，在反應混合液中加入1mol/L的 NaOH溶液，調節溶液的pH值至10-12，使其所有的羧酸全部轉化為鈉鹽，將混合溶液倒入到丙酮中進行重沉淀，然后在水溶液中透析，除去未反應的丙烯酸，透析兩天后，冷凍干燥得到N-羧乙基殼聚糖；

2）納米氧化鋅顆粒制備：稱取1.3225gZnAc₂·2H₂O溶解在20mL的蒸餾水中,緩慢滴加9mL 5mol/L的NaOH溶液，溶液先出現白色渾濁,繼續滴加則渾濁完全消失，再加入11mL的蒸餾水，攪拌均勻，然后倒入低壓反應釜中，將反應釜放入烘箱中，在170℃下加熱12個小時，自然冷卻至室溫后,得到沉淀后，分別用水和乙醇清洗、離心兩次，將沉淀放入烘箱內于60℃烘干備用；

3）N-羧乙基殼聚糖與納米氧化鋅混合溶液的制備：將5.00gN-羧乙基殼聚糖加入到300mL去離子水中，在室溫下劇烈攪拌0.5h，充分溶解得到水溶性殼聚糖溶液，將上述水溶性殼聚糖溶液和納米氧化鋅按一定的比例混合，將混合液劇烈攪拌3h，使其混合均勻；

4）膠體金的制備：

將裝有95-105ml純化水的圓底燒瓶放入電熱套指定位置加熱，接通電熱套電源，加熱10-12分鐘后，待燒瓶中水即沸騰之時、開啟轉數控制開關，調至350-400rpm，并用注射器緩慢加入1ml 1%氯化金溶液，之后快速加入1%檸檬酸三鈉溶液1-2ml，待溶液冷卻到室溫后，加水稱重補足重量；

5）氧化鋅-殼聚糖-膠體金制備：以苯二甲醛作為交聯劑，在常溫下進行交聯；交聯結束，將所得的氧化鋅-殼聚糖-膠體金洗滌，真空干燥20-24h；

（b）氧化鋅-殼聚糖-膠體金交聯記抗人IgM抗體，取1ml氧化鋅-殼聚糖-膠體金懸浮液，超聲分散均勻，然后邊攪拌邊滴加抗體，加入抗體后，反應 1-2min后，再到超聲波上超聲20-30秒，然后再反應2-3小時，加 BSA進行封閉24小時，封閉好后進行離心，速度為 10000-12000r/min，20-25min，保留離心后的沉淀，待用；

（c）采用膠體金抗體緩沖液分別稀釋步驟（b）離心后的沉淀氧化鋅-殼聚糖-膠體金抗體，使其分散均勻，分別獲得免疫膠體金抗體溶液，分別用免疫膠體金抗體溶液噴涂于玻璃纖維墊，制得免疫膠體金抗體玻璃纖維膜；

（d）將硝酸纖維素膜用聚多巴胺處理液預處理后，噴點肺炎鏈球菌抗原、流感嗜血桿菌抗原、金黃色葡萄球菌抗原、肺炎克雷伯桿菌抗原、肺炎支原體抗原、肺炎衣原體抗原作為檢測線，噴點羊抗鼠IgG抗體作為質控線，制得免疫硝酸纖維素膜；

（e）將預處理的樣品墊、步驟（c）制備的免疫膠體金玻璃纖維膜、步驟（d）制備的免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在塑料板上，切裁制得檢測試劑條，最后將檢測試劑條裝入塑料外殼。

2.根據權利要求1所述的一種呼吸道細菌聯合檢測裝置的制備方法，其特征在于：所述步驟（a）氧化鋅-殼聚糖-膠體金制備中，1）N-羧乙基殼聚糖的合成，在水溶液中透析時，采用的透析膜截取分子量為 8000-12000g/mol。

3.根據權利要求1所述的一種呼吸道細菌聯合檢測裝置的制備方法，其特征在于：所述步驟（a）氧化鋅-殼聚糖-膠體金制備中，2）納米氧化鋅顆粒制備，緩慢滴加9mL 5mol/L的NaOH溶液，該NaOH溶液為新配制的溶液。

4.根據權利要求1所述的一種呼吸道細菌聯合檢測裝置的制備方法，其特征在于：所述步驟（a）氧化鋅-殼聚糖-膠體金制備中，3）N-羧乙基殼聚糖與納米氧化鋅混合溶液的制備，所述水溶性殼聚糖溶液和納米氧化鋅的混合比例是，N-羧乙基殼聚糖與氧化鋅的質量之比為 100/5、100/8或100/10。

5.根據權利要求1所述的一種呼吸道細菌聯合檢測裝置的制備方法，其特征在于：所述步驟（c）所述的膠體金抗體緩沖液包括：濃度為20mM Tris-HCL液、蔗糖濃度為5%、海藻糖濃度為1%、proclin濃度為1%，BSA濃度為1%，pH為8.5。