[發明專利]一種奶牛趾間皮膚外植體模型構建方法

在審

• 申請號: 202210401138.7
• 申請日: 2022-04-18
• 公開（公告）號: CN114591891A
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 鄭家三;葛延松;張鶴飛;周志新;孫悅;楊春雪;岳洋;范春玲
• 申請（專利權）人: 黑龍江八一農墾大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 吳波

本發明提供了一種奶牛趾間皮膚外植體模型構建方法，發明所屬研究領域為皮膚外植體模型技術領域。模型構建方法包括以下步驟：將奶牛趾間皮膚浸入運輸培養基中運輸，運輸完成后使用洗滌培養基清洗奶牛趾間皮膚，將清洗后的奶牛趾間皮膚培養于含有組織培養基的細胞小室中，完成模型構建；最后對奶牛趾間皮膚外植體模型進行可行性評估。本發明所構建3D奶牛趾間皮膚模型符合減少、替代、優化等實驗動物3R原則，同時所構建的模型能夠維持良好的組織結構完整性，充分模擬奶牛趾間皮膚在體環境，對深入研究奶牛趾間皮膚病原微生物侵入作用機制具有重要意義。

技術領域

本發明涉及皮膚外植體模型技術領域，具體涉及一種奶牛趾間皮膚外植體模型構建方法。

背景技術

隨著畜牧養殖行業的快速發展，奶牛肢蹄病已經成為繼乳房炎和繁殖障礙之后危害奶牛健康養殖的第三大疾病，奶牛肢蹄病是對由環境、管理、營養以及生理等多種不良飼養因素引起奶牛肢蹄部位發生病變的總稱。據聯合國糧農組織統計，在發達國家奶牛肢蹄病發病率為15％；在發展中國家發病率高達30％～40％。肢蹄病可導致奶牛生產和繁殖性能降低、利用年限縮短以及治療費用增加等，給奶牛產業帶來巨大的經濟損失。

奶牛趾間皮膚常見感染性疾病包括腐蹄病、蹄皮炎、趾間皮炎等。患病奶牛蹄部皮膚常表現出壞死和裂開，炎癥自趾間向皮膚各處蔓延，并伴有全身性癥候，奶牛趾間感染性蹄病已經成為一類影響奶牛肢蹄健康的重要群發性疾病。國內外對該類疾病的的炎癥發病機理報道較少，究其原因，主要是對奶牛趾間皮膚研究受到實驗動物3R(Replacement，Reduction，Refinement)原則以及倫理學等因素的限制。奶牛趾間皮膚外植體模型既能夠滿足奶牛趾間皮膚感染性疾病研究需要，又符合實驗動物倫理要求，因此本發明能夠促進奶牛趾間皮膚感染機制的離體試驗深入研究，進而推動奶牛健康養殖的可持續性發展。

發明內容

本發明的目的在于提供一種奶牛趾間皮膚外植體模型構建方法，該方法構建的奶牛趾間皮膚外植體模型具有高穩定性、高重復性的特點，此外該模型的構建能夠大大降低實驗動物的使用頻率。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種奶牛趾間皮膚外植體模型構建方法，包括以下步驟：

將奶牛趾間皮膚浸入運輸培養基中運輸，運輸完成后使用洗滌培養基清洗奶牛趾間皮膚，將清洗后的奶牛趾間皮膚培養于含有組織培養基的細胞小室中，完成模型構建，最終對奶牛趾間皮膚外植體模型進行可行性評估；

所述運輸培養基的成分包括DMEM/F-12培養基、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液、硫酸慶大霉素、L-谷氨酰胺；

所述洗滌培養基的成分包括DMEM/F-12培養基、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液、硫酸慶大霉素；

所述組織培養基的成分包括高糖DMEM培養基，DMEM/F-12培養基、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液、硫酸慶大霉素、L-谷氨酰胺、胎牛血清。

優選地，所述運輸培養基中，硫酸慶大霉素的濃度為4～6μg/mL，所述DMEM/F-12培養基、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液與L-谷氨酰胺的體積比為(97.5～98.5)：(0.9～1.1)：(0.9～1.1)。

優選地，所述洗滌培養基中，硫酸慶大霉素的濃度為1～3μg/mL，所述DMEM/F-12培養基與青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液的體積比為(98.5～99.0)：(0.9～1.1)。

優選地，所述組織培養基中，所述高糖DMEM培養基、DMEM/F-12培養基、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液、L-谷氨酰胺與胎牛血清的體積比為(63～66)：(21～22)：(0.9～1.1)：(0.9～1.1)：(9～11)，所述硫酸慶大霉素的濃度為4～6μg/mL。

優選地，所述清洗的次數為2～4次，每次10～20min。