[發(fā)明專利]檢測血漿中tRF型胃癌分子標記物以及在制備胃癌輔助診斷試劑盒的應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210400613.9
• 申請日: 2022-04-16
• 公開（公告）號: CN114875146A
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發(fā)明（設計）人: 宋雪梅;郭俊明;謝瑤瑤;張雙雙;俞秀沖;翁秋燕
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11;C12Q1/6851
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 徐雪波;葉桂萍

1.一種用于胃癌輔助診斷的檢測試劑盒，其特征在于：包括用于檢測血漿樣本中tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B、tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的其中一個或是四個聯(lián)合的試劑，其中：

tRF-18-79MP9P04的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述tRF-18-79MP9P04在胃早癌患者血漿中顯著下調；所述引物為：F1：5'-GTCCCTGTTGTGTTTCCGTAG 3'；R1：5'-GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT-3'；

tRF-30-87R8WP9N1EWJ的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述tRF-30-87R8WP9N1EWJ在胃早癌患者血漿中顯著上調；F2：5'-GTGTCCCTGGTGGTCTAGTGGTT-3'；R2：5'-GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT-3'；

tRF-21-V2989UV3B的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述tRF-21-V2989UV3B在胃早癌患者血漿中顯著上調；F3：5'-CGTTGGTAGGATGGGGTGTGA-3'；R3：5'-GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT-3'；

tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述RF-33-P4R8YP9LON4VDP在胃早癌患者血漿中顯著下調；F4：5'-GCATGGGTGGTTCAGTGGTAGA-3'；R4：5'-GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT-3'。

2.根據(jù)權利要求1所述的用于胃癌輔助診斷的檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括有tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B以及tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的逆轉錄引物序列，其中，

tRF-18-79MP9P04的逆轉錄序列如SEQ ID No.5所示：5'-GCAGACGAGGGTACCTCCTCTCTTCTCTACTCGTGTCCTACCCTCGTCTGCCCACTA-3'；

tRF-30-87R8WP9N1EWJ的逆轉錄序列如SEQ ID No.6所示：5'-GCAGACGAGGGTACCTCCTCTCTTCTCTACTCGTGTCCTACCCTCGTCTGCGCCGAA-3'；

tRF-21-V2989UV3B的逆轉錄序列如SEQ ID No.7所示：5'-GCAGACGAGGGTACCTCCTCTCTTCTCTACTCGTGTCCTACCCTCGTCTGCTACCTA-3'；

tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的逆轉錄序列如SEQ ID No.8所示：5'-ACAGACGAGGGTACCTCCTCTCTTCTCTACTCGTGTCCTACCCTCGTCTGTCAGGCG-3'。

3.根據(jù)權利要求1或2所述的用于胃癌輔助診斷的檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括有tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B以及tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的探針引物序列，其中，

tRF-18-79MP9P04的探針引物序列如SEQ ID No.9所示：5'-FAM-TGTCCTACCCTCGTCTGCCCACTA-TAMRA-3'；

tRF-30-87R8WP9N1EWJ的探針引物序列如SEQ ID No.10所示：5'-FAM-GGATTCGGCGCAGACGAGGGTAGGA-TAMRA-3'；

tRF-21-V2989UV3B的探針引物序列如SEQ ID No.11所示：5'-FAM-AGGTAGCAGACGAGGGTAGGACAC-TAMRA-3'；

tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的探針引物序列如SEQ ID No.12所示：5'-FAM-TTCTCGCCTGACAGACGAGGGTAGGA-TAMRA-3'。

4.一種檢測血漿中tRF分子標記物的方法，其特征在于，所述tRF分子標記物為權利要求1中所述的tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B以及tRF-33-P4R8YP9LON4VDP，所述的方法包括如下步驟：

(1)采集血液，提取血漿中的總RNA；

(2)將總RNA逆轉錄成cDNA；

(3)利用tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B以及tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的特異性擴增引物對步驟(2)的cDNA溶液進行熒光定量PCR檢測，反應結束后檢測熒光信號值并設定Y值；

(4)獲得每個樣品的Cq值，也就是y值，并按所檢測tRF對應的標準曲線計算出相應的拷貝數(shù)x后，將按照400×10^x/3計算每個樣品對應1mL血漿時的拷貝數(shù)，并進行早期胃癌患者1mL血漿內tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B、tRF-33-P4R8YP9LON4VDP拷貝數(shù)的統(tǒng)計學分析。