[發明專利]可口革囊星蟲甲基化位點檢測引物、擴增體系

在審

• 申請號: 202210397320.X
• 申請日: 2022-04-15
• 公開（公告）號: CN116200501A
• 公開（公告）日: 2023-06-02
• 發明（設計）人: 吳雪萍;張輝;王文杰;黃少君
• 申請（專利權）人: 廣西民族大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京卓嵐智財知識產權代理有限公司 11624
• 代理人: 宋文婉

1.可口革囊星蟲甲基化位點檢測引物，其特征在于：包括細胞色素B、合酶F0亞基8和脫氫酶亞基3的特異性擴增引物，其中，引物的序列分別為：

正向引物M1F：5'ATTAATTATTTTAATTATATTTTAATGATGA?3'

反向引物M1R：5'TTCAATACCAATTAATAATCAACAAC?3'

正向引物M2F：5'TATTTTTTYGGTTATTAGAAGTAGATAAT?3'

反向引物M2R：5'AAATTATTTTTATAAAATCTTCTAAAAAAC?3'

正向引物M3F：5'TTTAATATTTTATATGAGTTGAGTTTAGAT?3'

反向引物M3R：5'ATTAATCTAAAAATTATTCCTTTTCC?3'。

2.根據權利要求1所述的可口革囊星蟲甲基化位點檢測引物的PCR擴增體系，其特征在于：包括反應體系和反應條件，反應體系包括1-2μL模板DNA、1μL?M1F、1μL?M2F、1μL?M3F、1μL?M1R、1μL?M2R、1μL?M3R、1μL?dNTP、51μL?Taq?Buffer、0.4μL?Taq酶、50μL?ddH2O，其中模板DNA的濃度為20-50ng/μL，M1F、M2F、M3F、M1R、M2R和M3R的規格均為10μM，dNTP的規格為10μM，Taq?Buffer的規格為10X，Taq酶的規格為5U/μL；

反應條件為95℃預變性3-5min，94℃變性30sec，55-60℃退火25-30sec，72℃延伸30-50sec，35個循環，72℃修復延伸5-8min。

3.根據權利要求2所述的可口革囊星蟲甲基化位點檢測引物的PCR擴增體系，其特征在于：用于檢測可口革囊星蟲甲基化位點。

4.根據權利要求3所述的可口革囊星蟲甲基化位點檢測引物的PCR擴增體系，其特征在于：檢測的具體過程包括如下步驟：

步驟1：基因組DNA的提取，在-20℃冰箱中取體壁樣品75mg，待其解凍后用消毒后的剪刀將所采樣品剪下黃豆大小的組織塊并將其剪碎，使用柱式動物組織基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，共提取3個可口革囊星蟲個體的基因組DNA，所提取的DNA置于-20℃保存備用；

步驟2：基因組DNA的濃度及純度的檢測，通過分光光度計檢測提取到的三個組織樣的DNA純度和濃度；

步驟3：取實驗驗證過的合格基因組DNA，每個個體的DNA量為1μg，進行亞硫酸氫鹽轉化，并對轉化后的DNA進行脫鹽、脫磺基并純化回收；

步驟4：引物設計，首先查找3個基因的啟動子序列；若啟動子序列無法確定，查找第一外顯子前面的2000bp序列；若第一外顯子前面的2000bp序列中檢測到CpG島，則人為選擇CG位點相對比較密集的區域作為檢測區域，利用Primer5.0設計細胞色素B、合酶F0亞基8和脫氫酶亞基3基因各自的特異性擴增引物，得到的片段長度分別為223bp、279bp和294bp；

步驟5：將經亞硫酸氫鹽轉化后的DNA作為模板，利用設計的引物序列，對細胞色素B、合酶F0亞基8和脫氫酶亞基3基因的選定序列進行BSP產物的PCR擴增，按照反應體系和反應條件進行擴增；

步驟6：PCR產物的檢測與純化回收，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測BSP擴增產物，而后使用柱式微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對檢測合格的BSP擴增產物進行切膠回收；

步驟7：測序及測序結果分析,對測序產生的原始序列依據基因組規模DNA甲基化測序數據處理，在完成樣品DNA提取之后，利用UV-Vis?Spectrophotometer測定三個組織樣的純度和濃度，3個組織樣的DNA濃度分別為820.38ng/μL、84.83ng/μL、133.63ng/μL，樣品較為完整，DNA樣品的降解情況和丟失量符合下游實驗的標準，對三個基因選定序列進行PCR擴增得到擴增結果。