[發明專利]一種分離培養搖蚊科昆蟲腸道細菌的方法

在審

• 申請號: 202210387079.2
• 申請日: 2022-04-14
• 公開（公告）號: CN114540256A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 安佳婷;徐海軒;孫文雯;孫澤陽;閆春財
• 申請（專利權）人: 天津師范大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12Q1/6869;C12Q1/04
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

1.一種分離培養搖蚊科昆蟲腸道細菌的方法，其特征在于：按如下的步驟進行：

一、預處理

1腸道組織剝離

（1）材料消毒：在無菌環境下，將搖蚊幼蟲置于冰上3-5 min使其昏迷后進行表面消毒，用75％的酒精棉片輕輕擦拭幼蟲表面30 s，0.25％的無菌次氯酸鈉沖洗幼蟲表面1 min，無菌生理鹽水沖洗浸泡幼蟲表面三次，每次1 min，去除蟲體表面殘留液體；

（2）材料處理：將體表消毒好的搖蚊幼蟲放在培養皿中載玻片上，使用滅菌后的解剖刀切開幼蟲口器和尾部，用滅菌后的鑷子從幼蟲頭部輕輕取出腸道，立即用無菌生理鹽水漂洗腸道，去除其它內臟及其附屬物，采集腸道及其內容物；

2菌落培養

（1）菌液制備：在1.5 mL的離心管中加入1 mL PBS緩沖液，將剖離的腸道裝入無菌離心管中，用勻漿器將腸道充分研磨形成勻漿后備用；

（2）菌液稀釋：將上述提取的腸道勻漿液稀釋為10^-3、10^-4、10^-5三個梯度，分別取100 μL溶液均勻涂布于NA、LB、BHI、MC培養基上；

（3）平板倒置放入人工氣候箱中37℃培養72 h，選擇菌落分散較好，單菌落數目在30-300株的培養皿，每24 h根據菌落特征，分別挑取形態、大小、顏色不同的單菌落在新的培養基上劃線純化培養3-5次，直至得到形態穩定的單克隆菌株；

3菌落形態鑒定

觀察并記錄單菌落的顏色，形狀及質地等特征，經過革蘭氏染色后在光學顯微鏡下觀察單個細菌的革蘭氏染色情況、菌體形狀、有無鞭毛等特征，剔除重復菌株；

二、細菌基因組DNA的提取及分子鑒定

1擴繁：在玻璃試管中加入3 mL培養基并接種純化的單克隆菌株，搖床設置為36℃，220/RPM，試管放入搖床三天，直至菌液OD值為0.7-1.0即可取出；

2提取基因組DNA

（1）取1.5 mL離心管，加入上述菌液后離心機室溫，8000/RPM離心1 min，棄上清；

（2）使用細菌基因組DNA抽提試劑盒中的試劑提取細菌基因組DNA：加入180 μL BufferDigestion，80 μL溶菌酶，振蕩混勻后放入37℃水浴鍋中水浴60 min，每隔10 min上下顛倒混勻一次；

（3）加入20 μL Proteinase K,震蕩混勻后56℃水浴過夜；

（4）加入20 μL RNase A（10 mg/mL），室溫放置30 min；

（5）加入200 μL Buffer BD，充分混勻，70℃水浴10 min；

（6）加入200 μL無水乙醇，充分混勻；

（7）將吸附柱放入收集管中，管內物質移入收集管柱中，靜置2 min，再12000/RPM室溫離心1min，倒掉收集管中的廢液；

（8）加入500 μL PW Solution，12000/RPM離心1 min；

（9）加入500 μL Wash Solution，12000/RPM離心1 min，此步驟重復2次；

（10）離心管12000/RPM空轉2 min，倒掉廢液，打開吸附柱蓋子于室溫放置5 min；

（11）取新的1.5 mL離心管，加入80mL CE Buffer，靜置5 min，12000/RPM離心2 min，收集DNA溶液；產物立即使用或保存于-20℃冷凍；

3分子鑒定：

（1）擴增菌體的16S rRNA基因序列后測序，擴增菌體的16S rRNA基因序列使用細菌通用引物27F和1492R擴增；

（2）獲得的菌株序列通過DNAMAN軟件進行矯正及拼接，拼接完成后的16S rRNA序列提交到http://www.ncbi.nlm.nih.gov中與GenBank核酸數據庫中的序列進行BLAST同源性比對，查找并選出與菌株相似度最高的序列作為參照菌株并下載核酸序列，使用ClustalW軟件比對序列，運用軟件MEGA X以鄰位相連算法（Neighbor-Joining）構建系統發育樹，判定其親緣關系。

2.權利要求1所述一種分離培養搖蚊科昆蟲腸道細菌的方法在用于快速分離搖蚊幼蟲完整腸道，同時從腸道中獲得可培養微生物方面的應用。