[發(fā)明專利]一種可以分泌溶解性多糖單加氧酶的工程菌株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210385905.X
• 申請日: 2022-04-13
• 公開（公告）號: CN114853904A
• 公開（公告）日: 2022-08-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張?zhí)煸?/a>;邵雄俊;薛怡蕓
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州聚維元創(chuàng)生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/74;C12N1/21;C12P19/02;C12R1/145
• 代理公司: 天津市君硯知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12239
• 代理人: 高文迪

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體提供了一種可以分泌溶解性多糖單加氧酶的工程菌株，其特征在于：所述工程菌株為帶有用于重組表達溶解性多糖單加氧酶基因Tfu_1665的熱纖梭菌工程菌株，溶解性多糖單加氧酶（LPMO）基因Tfu_1665來源于褐色高溫雙岐菌Thermobifida fusca YX，并通過將該溶解性多糖單加氧酶基因Tfu_1665導(dǎo)入熱纖梭菌中，構(gòu)建了重組表達該基因的熱纖梭菌工程菌。所述熱纖梭菌工程菌能高效表達溶解性多糖單加氧酶。本發(fā)明還公開了該熱纖梭菌工程菌株可以高效應(yīng)用于木質(zhì)纖維素的水解，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可以分泌溶解性多糖單加氧酶的工程菌株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

木質(zhì)纖維素是一類分布廣泛、數(shù)量龐大、處理困難的可再生資源，將其轉(zhuǎn)化成可再生能源具有重要意義。木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，纖維素是一種高度有序、結(jié)合緊密的晶體結(jié)構(gòu)，它與半纖維素緊密相連，外周由木質(zhì)素包圍，要將纖維素直接水解成可利用的葡萄糖相當(dāng)困難。

目前，傳統(tǒng)的木質(zhì)纖維素的酶水解大多使用來源于絲狀真菌的纖維素酶，比較典型的有木霉屬、曲霉屬和青霉屬等，但酶解過程中耗酶量高、活性極易受到產(chǎn)物的抑制，且這些酶蛋白不耐高溫，不耐酸堿，制約了其大規(guī)模應(yīng)用。

嗜熱纖維梭菌是目前自然界中已知的降解纖維素最高效的微生物之一，分泌的纖維小體具有極強的纖維素降解能力。纖維小體降解纖維素的能力大約是木霉屬的50倍，這種高效性取決于纖維小體的特殊結(jié)構(gòu)。熱纖梭菌本身是一種嚴格厭氧的嗜熱微生物，特殊的生長條件，使得分泌的木質(zhì)纖維素水解酶具有較好的耐熱性、雜菌污染的風(fēng)險極小。

溶解性多糖單加氧酶（LPMO）是一種全新的木質(zhì)纖維素降解酶，傳統(tǒng)的木質(zhì)纖維素降解過程主要是在外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖酶等一系列水解酶的作用下，通過打斷糖苷鍵的方式來降解木質(zhì)纖維素，而溶解性多糖單加氧酶能夠通過氧化作用斷裂糖苷鍵產(chǎn)生寡糖鏈，暴露更多糖苷水解酶結(jié)合的位點，從而加快反應(yīng)進程，提高寡糖或單糖的生成量。有研究表明，達到同樣的水解轉(zhuǎn)化率，添加溶解性多糖單加氧酶可以使纖維素酶用量減少一半，因此將溶解性多糖單加氧酶結(jié)合熱纖梭菌纖維小體應(yīng)用于木質(zhì)纖維素酶水解中可以有效提高水解效率。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種可以分泌溶解性多糖單加氧酶的工程菌株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，通過溶解性多糖單加氧酶的協(xié)同作用增強了熱纖梭菌的酶水解效率，在相同酶解條件下，相比傳統(tǒng)的纖維素酶水解，不僅水解時間短，水解率也更高。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明一方面提供了一種可以分泌溶解性多糖單加氧酶的工程菌株，所述工程菌株為帶有用于重組表達溶解性多糖單加氧酶基因Tfu_1665的熱纖梭菌工程菌株。

所述菌株為將熱纖梭菌cel9K基因中SEQ ID No:1所示的核苷酸序列替換為溶解性多糖單加氧酶基因Tfu_1665重組得到的工程菌。

所述溶解性多糖單加氧酶基因Tfu_1665具有如SEQ ID No:2所示的核苷酸序列。

所述溶解性多糖單加氧酶基因Tfu_1665來源于褐色高溫雙岐菌（Thermobifida fusca YX）。

本發(fā)明另一方面提供了一種可以分泌溶解性多糖單加氧酶的工程菌株的構(gòu)建方法，將溶解性多糖單加氧酶基因Tfu_1665導(dǎo)入熱纖梭菌基因組上，構(gòu)建重組表達該基因的熱纖梭菌工程菌，得到可以分泌溶解性多糖單加氧酶的工程菌株。