[發明專利]重組載體及其在構建糖尿病視網膜病變小鼠模型中的應用

在審

• 申請號: 202210380327.0
• 申請日: 2022-04-12
• 公開（公告）號: CN114606266A
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發明（設計）人: 王艷歌;肖二衛;李苗;王剛;史平玲;宋宗明;陶冶;但漢東;張貝貝;杜恩明;魏圓夢;王嬌嬌;李曉麗;唐賀;黃子旭
• 申請（專利權）人: 河南省人民醫院
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N5/10;C12N15/113;C12N15/65;A01K67/027
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

本發明屬于動物模型技術領域，具體涉及重組載體及其在構建糖尿病視網膜病變小鼠模型中的應用。所述重組載體是將SEQ ID NO.1第9?492位所示DNA序列插入pAV?CMV?GFP?miRNA載體的AsisI和MluI位點之間獲得的。所述重組病毒是將包裝質粒、輔助質粒和所述重組載體共轉染至HEK?293T細胞，培養72h后收集病毒獲得的。對STZ誘導的小鼠進行高脂高糖飲食喂養建立糖尿病小鼠，通過玻璃體腔注射所述重組病毒促進其疾病進程，可形成糖尿病視網膜病變的小鼠模型，其自帶熒光，易于觀察視網膜病變，成模周期較短，動物成活率高，且壽命較長。

技術領域

本發明屬于動物模型技術領域，具體涉及重組載體及其在構建糖尿病視網膜病變小鼠模型中的應用。

背景技術

近年來，糖尿病(DM)的發病率持續增加，嚴重影響人們的生活與健康。糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病微血管并發癥，也是導致患者視力障礙或失明的重要原因。長期高血糖是DR患者發病的直接因素，最終導致患者微血管和視網膜損傷，甚至失明。根據病理變化，DR發展階段包括非增殖性糖尿病視網膜病變(NPDR)和增殖性糖尿病視網膜病變(PDR)。NPDR始于微血管病變，包括周細胞損失與內皮細胞損傷，血視網膜屏障的血管通透性增加，糖尿病性黃斑水腫、微動脈瘤、斑點狀出血和棉絨斑。NPDR可進一步發展為PDR，且發病率隨著病程的增加而增加。未治療的PDR的并發癥有玻璃體出血和牽拉性視網膜脫離。所以PDR是引起DR患者視網膜功能障礙的主要因素。

治療DR主要取決于對糖尿病黃斑水腫和新生血管階段的治療。DR中抗血管內皮生長因子(VEGF)的發現是臨床一個里程碑式的進展。目前，抗VEGF和糖皮質激素是DR并發癥的主要治療方法。然而，大部分的糖尿病黃斑水腫患者對這些單一療法具有抗藥性，而一小部分患者對雙重療法也具有抗藥性，從而導致視力下降。因此，DR的治療急需一種新療法，最終逆轉疾病進程。而動物模型為DR的研究和開發新一代眼科療法提供了手段。

動物模型在DR的病理生理學、進展和病因學的研究中有至關重要的作用。嚙齒動物成本低、壽命短、繁殖速度快，是DR動物模型中應用最廣泛的。犬類DR的表型與人類DR非常相似，然而，倫理問題和成本效率阻礙其廣泛應用。相比其他動物，大小鼠比較易于表現DR的發病機制。目前，有幾種方法可誘導不同階段的DR，包括藥物誘導、基因編輯、環境暴露和外科手術等方法。在1型糖尿病(T1DM)中，DR的藥理學誘導是通過四氧嘧啶或抗生素鏈脲佐菌素(STZ)給藥破壞胰腺實現的。由于STZ顯型速度更快，是誘導DR的首選藥物。然而，STZ誘導的DR模型很少發生PDR。所以，目前還未有動物模型可完全模擬人DR的整個發病進程。

因此，急需開發一種新的DR高階動物模型可模擬人類糖尿病視網膜病變。

發明內容

本發明的目的在于彌補現有技術的空白，提供重組載體及其在構建糖尿病視網膜病變小鼠模型中的應用。

第一方面，本發明提供一種重組載體，是將SEQ ID NO.1第9-492位所示DNA序列插入pAV-CMV-GFP-miRNA載體的AsisI和MluI位點之間獲得的。

第二方面，本發明提供含有所述重組載體的重組病毒。

第三方面，本發明提供所述重組病毒的構建方法，是將包裝質粒、輔助質粒和所述重組載體共轉染至HEK-293T細胞，培養72h后收集病毒，得到所述重組病毒。

第四方面，本發明提供所述重組病毒在構建糖尿病視網膜病變小鼠模型中的應用。

第五方面，本發明提供一種構建糖尿病視網膜病變小鼠模型的方法，包括以下步驟：

給小鼠注射濃度為10mg/ml的STZ溶液，注射后持續高脂高糖高膽固醇喂食，然后玻璃體腔注射所述重組病毒，一個月后，再注射一次，得到所述糖尿病視網膜病變小鼠模型。

進一步的，所述小鼠為8周齡的雄性小鼠。