[發明專利]一種在酵母中建立基于紅色熒光蛋白的雙分子熒光互補系統的方法

在審

• 申請號: 202210378858.6
• 申請日: 2022-04-12
• 公開（公告）號: CN114839382A
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: 王建;商立民;劉禹辰;金超智;田春艷;原艷芝;宓慶坤
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/533;C12N15/81;C07K19/00;C12N15/62;G01N21/64
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 張立娜

本發明公開了一種在酵母中建立基于紅色熒光蛋白的雙分子熒光互補系統的方法。該方法包括：將yEmRFP(SEQ ID No.1)分成N端(第1?159位)和C端(第160?236位)；在N端編碼基因5’或3’端通過連接序列(編碼SEQ ID No.2所示連接肽)連接目的蛋白A的編碼基因，形成融合基因片段A；在C端編碼基因5’或3’端通過所述連接序列連接目的蛋白B的編碼基因，形成融合基因片段B；將融合基因片段A和B導入受體酵母細胞，培養所得轉基因酵母細胞，檢測其是否產生紅色熒光，若產生紅色熒光，則目的蛋白A與B互作；若不產生紅色熒光，則目的蛋白A與B不互作。本發明建立的BiFC技術具有較高的敏感性和特異性，適合于在酵母中開展蛋白質相互作用篩選。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種在酵母中建立基于紅色熒光蛋白的雙分子熒光互補系統的方法。

背景技術

蛋白質間的互作構成生命活動的基礎，在后基因組時代，科研人員已經建立了包括細菌、酵母、擬南芥、線蟲和人類在內等的多個物種的蛋白質互作網絡，并在此基礎上鑒定了許多蛋白質的新功能及其在蛋白質互作網絡中的作用，為揭示蛋白質在生命活動過程中的作用奠定了基礎。然而現有網絡中含有的相互作用蛋白數目距離理論估算的數目仍有較大差距，這其中很大一部分原因是由于實驗技術本身的缺陷所導致的。例如酵母雙雜交技術只能用于入核蛋白的相互作用研究，其技術本身還存在著自激活和假陽性等問題，且實驗周期較長，工作量較大。而親和純化串聯質譜技術主要是針對蛋白質復合體的相互作用進行研究，在蛋白質純化的過程中會丟失一些較弱的相互作用，其后續的蛋白質分析和檢測費用較高且需要較為專業的生物信息學知識對質譜結果進行分析。因此，開發快速、簡便、可信性好的蛋白質相互作用新技術將會在規模化蛋白質相互作用研究中發揮重要作用。

Hu等于2002年開發出了在哺乳細胞中表達的基于黃色熒光蛋白(Venus)的雙分子熒光互補系統(bimolecular fluorescent complementation,BiFC)，該系統將Venus在154個氨基酸處分別VN154和VC154兩個無熒光片段，這兩個片段在細胞內共表達或體外混合時，不能自發地組裝成熒光蛋白。但是當這兩個熒光片段分別連接到一對有相互作用的蛋白上并在細胞內共表達或體外混合時，由于目標蛋白質之間的相互作用，熒光蛋白的兩個片段在空間上互相靠近，重新構建成完整的具有活性的熒光蛋白分子而發出熒光。BiFC技術具有試驗周期耗時短、操作簡單和無需添加發光物質等優點。然而現有的適合于哺乳動物細胞中表達的BiFC系統在酵母和植物中表達時存在著熒光信號弱，背景值高等問題，因此需要在酵母中建立一種經濟、方便且具有高熒光值、低背景的BiFC系統用于蛋白質相互作用研究。

發明內容

本發明的目的是提供一種在酵母中建立基于紅色熒光蛋白的雙分子熒光互補系統的方法。

第一方面，本發明要求保護一種檢測目的蛋白A與目的蛋白B是否為互作蛋白的方法。

本發明要求保護的檢測目的蛋白A與目的蛋白B是否為互作蛋白的方法，可包括如下步驟：

(1)將紅色熒光蛋白分成N端部分和C端部分；在所述N端部分的編碼基因的5’末端或3’末端通過連接序列(linker)連接目的蛋白A的編碼基因，形成融合基因片段A；在所述C端部分的編碼基因的5’末端或3’末端通過所述連接序列(linker)連接目的蛋白B的編碼基因，形成融合基因片段B。

所述紅色熒光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述N端部分的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第1-159位所示；所述C端部分的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第160-236位所示；所述連接序列(linker)編碼SEQ ID No.2所示連接肽。

其中，所述連接肽的加入是為了使目的蛋白能夠充分折疊。